保存稳定的纤维蛋白原溶液制造技术

提供了稳定保存即用式、生物相容性的哺乳动物纤维蛋白原的方法，不论其浓度，仍然保持流体形式，且长期允许快速简易加工成组织胶粘剂制剂。还提供了用本发明专利技术的方法得到的无菌、保存稳定的含水纤维蛋白原产品，其中纤维蛋白原长期保持即用的液体形式，未自发凝结（即，甚至在无激活剂，例如凝血酶／Ｃａ↑［＋＋］的存在下就形成凝块），并保持其生物活性（即，暴露于凝血酶和Ｃａ↑［＋＋］中并与之剧烈混合后快速形成血纤维蛋白凝块的能力）。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及保存稳定的、浓缩纤维蛋白原制剂和一种由此阻止失血、促进伤口愈合、和许多其它治疗性或非治疗性用途的使用方法。相关申请参考本申请要求2001年10月3日提交的美国临时申请No.60/326,963的优先权，此处将其全文引做参考。
技术介绍
纤维蛋白原是一种血浆蛋白，它在哺乳动物维持止血和防止失血的凝固最后阶段中起重要作用。哺乳动物中的凝血块形成，即血液凝结，是通过一个复杂的级联反应发生的，在级联事件的最后步骤中，纤维蛋白原单体与凝血酶和激活因子XIII在钙离子存在下反应形成含有交联血纤维蛋白聚合体的血纤维蛋白凝块。血浆蛋白中浓度为2～4克/升的纤维蛋白原单体，由三对经二硫键相连的多肽链组成。这些多肽链称作(Aα)2、(Bβ)2(分别表示α和β链的两个小氨基末端肽)和γ2。凝血酶从纤维蛋白原切割血纤维蛋白肽A产生化合物血纤维蛋白I，之后切割血纤维蛋白肽B产生最终的化合物血纤维蛋白II。该切割仅轻微地将纤维蛋白原的分子量从340,000道尔顿降低为334,000，但是这一过程却暴露出重要的形成汇聚且交联的血纤维蛋白凝块的聚合反应位点。参见，Jackson，Ann.Rev.Biochem 49765-811(1980)；Furie等人，Cell 53505-518(1988)。最近，已开发出含有纤维蛋白原、凝血酶和其它成分的生物胶粘剂，它模拟自然凝固的最后阶段，从而产生血纤维蛋白凝块。对所谓的血纤维蛋白封闭剂或组织封闭剂、生物封闭剂、血纤维蛋白胶或组织胶、对生物胶粘剂、或类似物(本文中都是指“血纤维蛋白封闭剂”)这些物质的测试显示出抗张强度与最终的纤维蛋白原浓度有正比关系(日本专利未审公开申请，Kokai No.Sho61-293443)。因此，浓缩纤维蛋白原的可获得性对于常规的血纤维蛋白封闭剂的制备是重要的。基于纤维蛋白原的组织胶粘剂是已知的，例如来自美国专利No.6,117,425(MacPhee等人)的。除了纤维蛋白原和因子XIII，这样的配方也可以包含其它的蛋白质，例如纤连蛋白和白蛋白，以及可任选地包含抗生素试剂、生长因子等等。所需的催化(凝血酶-介导的)活性可以由其所要应用的宿主组织(受伤表面)产生，或者在应用过程中以含凝血酶和Ca++离子的溶液或粉末的形式赋予组织胶粘剂。这样的血纤维蛋白封闭剂已被用于人或动物组织或器官部分的无缝和/或有缝结合，用于创伤封口、止血及促进伤口愈合，用于包埋假器官装置，以及用于许多其它治疗性或非治疗性用途。血纤维蛋白封闭剂中的纤维蛋白原成分来自收集的血浆，它常作为因子VIII制备过程中的废弃物。通过冷沉淀作用，或使用其它各种不同试剂，例如，聚乙二醇、乙醚、乙醇、硫酸铵、或甘氨酸的已知方法产生沉淀作用，可将纤维蛋白原从血浆中浓缩。例如，Brennan，Blood Reviews 5240-244(1991)；Gibble等人，Transfusion 30741-747(1990)；Matras，J.Oral Maxillofac.Surg.43605-611(1985)；Lerner等人，J.Surg.Res.48165-181(1990)等对血纤维蛋白封闭剂进行了综述。根据美国专利No.5,290,552，从制备的角度来看，早期的外科胶粘剂配方中必须包含高含量的纤维蛋白原(约8～10％)，很难由其制备冻干物。这样的冷沉淀物是相对不稳定的，需要在低于-20℃下保存直至使用。提高冷沉淀物稳定性的配方包括添加纤溶酶原激活剂的抑制剂或白蛋白。若纤维蛋白原浓度足够高，该制剂在伤口愈合过程中提供有效止血、良好的伤口和/或组织区域的封闭粘合性、高强度的粘合性和/或伤口封闭性、以及胶粘剂的完全可再吸收能力。为了优化粘合，更求在即可使用的组织胶粘剂溶液中的纤维蛋白原浓度为约15至60mg/ml(MacPhee，私人通信，1995)。组织胶粘剂或者以深度冷冻溶液或者以冻干物的形式出售。这是因为作为液体溶液，已知高度浓缩的纤维蛋白原是高度不稳定的(httpwww.tissuesealing.com/us/products/biological/monograph.cfm)，即，它会自发地凝结。所以，可商业获得的冻干和/或深度冷冻的纤维蛋白原浓缩物，例如Tissucol，目前必须在使用前液化，即，在使用前慢慢地融解(“熔化”)或者从冻干形式重构。然而，这两个液化过程都使得产品在能够使用之前非常费事以及造成相当长的时间拖延，这会使受伤的病人处于生命受到威胁的境地。深度冷冻浓缩物的“液化温度”，例如，将制剂从冰冻固体转化为液体的温度点，要求缓慢升高溶液温度——通常至少达25℃，更常见的是37℃以上，同时剧烈搅拌或振荡多至30～60分钟(http//www.tissuesealing.com/us/products/biological/monograph.cfm)。结果是，现有技术中的纤维蛋白原制剂的重构需更使用水浴或者其它加热装置(典型地在37℃)以在可能的最短时间内将深度冷冻材料转化为即可使用的溶液。然而，由于例如为保证产品的无菌条件而所必需的双层外包装典型地使热交换在整个困难且麻烦的融化步骤中更难进行。例如，预填充、即用式、无菌一次性注射器中的深度冷冻的血纤维蛋白封闭剂制剂为保证无菌必须是用塑料膜双层密封的。从深度冷冻固体向液体状态的转变不是急剧发生的，而是通过连续的升温步骤、经胶状及粘性过渡状态后发生的。根据至少一种试验，只有当试管倾斜时形成一个水平的液体水平面，即，样品流动后瞬间不会形成可见的突起，此时样品才可被称作“液体”。因此，为判断样品何时达到均匀的“液体”即用式状态而对样品进行的测试使得在保存的现有纤维蛋白原制剂可以使用之前增加了额外的费时步骤。此外，操作者一定程度的不确定性以及可能的出错显然会影响纤维蛋白原产品的有用性和有效性。冻干的纤维蛋白原的配制时间也在产品能够使用前产生显著的延误，这成为目前可获得的纤维蛋白原类止血剂使用中的一个实际问题。因此，已经进行了许多努力以改善冻干的纤维蛋白原制剂的溶解性能。例如，加热过程中生产者需要在蛋白质小瓶中使用磁性搅拌子以产生显著的振荡。与未经显著混合的相同产品相比，这会使其溶解时间更快，但也仍然需要30～60分钟的制备时间以仅仅得到可以立即使用的纤维蛋白原。病毒钝化方法的使用常进一步降低现有纤维蛋白原制剂的溶解度。这些方法优选通过对冻干材料进行热处理的方式来实施，例如根据EP 0 159 311。已知可以通过添加某些添加剂来改良对冻干物的重构。因此，例如，EP-0345 246描述了一种冻干的纤维蛋白原制剂，其中除纤维蛋白原外进一步包含至少一种生物学可接受的添加剂(表面活性剂)。表面活性剂的添加改进了冻干物与溶剂的润湿性，由此提高一定温度下的溶解速率，但不是提高纤维蛋白原自身的溶解度。因此，这样的制剂也必须在高于25℃，通常37℃的环境温度下重构。为了克服冻干或深度冷冻的纤维蛋白原产品，尤其是浓缩制剂，在使用前必须重构或液化这一要求，已经有在室温下可溶的某些纤维蛋白原制剂的介绍。然而，这样的现有产品是呈细胞毒性的(Beriplast，Biocol，Bolheal HG-4)。美国专利No.5,962,405本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种保存稳定的、浓缩、即用式、生物相容性的哺乳动物纤维蛋白原溶液，其中纤维蛋白原溶液的稳定性是ｐＨ和温度依赖性的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托弗J伍尔弗顿，
申请(专利权)人：克里斯托弗J伍尔弗顿，
类型：发明
国别省市：US[美国]