一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺高分子纳米药物载体的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺(PSI

A method of indirect competitive ELISA method for quantitative detection of oil amine grafting based on poly succinimide polymer nano drug carrier

The invention discloses a polysuccinimide indirect competitive ELISA method for quantitative detection of oil amine based on grafting (PSI

【技术实现步骤摘要】
一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺高分子纳米药物载体的方法
本专利技术涉及纳米材料的定量检测，特别涉及一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺(PSIOAm)高分子纳米药物载体的方法。
技术介绍
上世纪60年代，化学家们提出，可以将高分子材料应用于生物医药领域，合成一种高分子药物载体，用来改善药物结构，提高药效。高分子药物载体本身并不具备药理作用，也不与药物发生化学反应，而是以适当的方式(氢键、离子键或络合形式，主要为前者)与低分子药物结合。高分子化合物仅作为低分子药物的传递系统，真正发挥药理作用的仍是低分子药物。高分子纳米药物载体是指具有纳米尺度的高分子载体，实现对多肽分子、寡核苷酸、DNA、RNA和小分子化疗药物等多种药物的携载。药物分子通过物理或化学的方式包载在纳米材料载体上，形成药物-载体的复合体系。从20世纪末开始，越来越多的研究人员开始关注和构建用于药物输送的纳米载体，并且这些纳米药物载体在肿瘤治疗中展现出广阔的应用前景。纳米材料作为基因和药物载体的纳米学的出现，给癌症治疗注入了新的希望。近10多年,各种聚合物纳米载体被开发用于运载抗癌药物和蛋白质,实现对肿瘤的高效低毒治疗。尽管这些高分子纳米药物载体已步入临床试验阶段，但对这些物质的定量检测却鲜有报道，大部分已发表的期刊杂志关于高分子纳米药物载体的研究主要集中在以下几个方面：纳米载体的制备及表征、纳米载体与抗癌药物的偶联、抗癌药物在病灶部位的缓释效率及药效、纳米载体及其药物在生物体内的分布、体外细胞毒性测试等。可见对于纳米载体本身在生物体内的定量检测研究甚少。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺(PSIOAm)高分子纳米药物载体的方法，利用了二抗放大了检测信号，提高了实验分析的灵敏度，即通过测量PSIOAm包被抗原、PSIOAm抗体即一抗与HRP标记的羊抗兔抗体即二抗，三者复合物的光学性号达到定量检测PSIOAm的目的，该方法快速、简洁、检测限低，可进行高通量测定。本专利技术采取的技术方案为：一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺接枝聚琥珀酰亚胺(PSIOAm)高分子纳米药物载体的方法，所述方法包括以下步骤：a、制备PSIOAm包被抗原和免疫原；b、制备PSIOAm抗体：c、将PSIOAm包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的PSIOAm标准液，以PSIOAm抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗，进行间接竞争酶联免疫分析法；d、以PSIOAm标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，从而定量检测出PSIOAm的浓度。所述标准曲线的线性方程为A＝1.256-0.148lgC，其中A为490nm处吸光度值，C为PSIOAm浓度。其相关系数R2＝0.993，线性范围为10-2-104，检出限为0.03ng/mL所述步骤a具体包括以下步骤：a-1、水解PSIOAm，得到水解后的PSIOAm溶液；水解以使PSIOAm中的羧基暴露出来，更好的连接大分子蛋白以制备PSIOAm免疫原和PSIOAm包被抗原；a-2、向水解后的PSIOAm溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和牛血清白蛋白，20-30℃温育3-6小时后，离心分离，取沉淀分散于pH＝7.4的PBS缓冲液中即得到PSIOAm免疫原溶液；a-3、向水解后的PSIOAm溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和鸡卵清白蛋白，20-30℃温育3-6小时后，离心分离，取沉淀分散于pH＝7.4的PBS缓冲液中即得到PSIOAm包被抗原溶液；a-4、将PSIOAm免疫原溶液和PSIOAm包被抗原溶液分别置于透析袋中，以pH＝7.4的PBS缓冲液透析12-16h后收集，即可得到PSIOAm免疫原和PSIOAm包被抗原。所述步骤a-1具体包括以下步骤：将浓度为60mg/mL的油胺接枝聚琥珀酰亚胺的三氯甲烷溶液0.1-0.5mL，分散在1-6mL0.1-1mmol/LNaOH中，超声5-10min，得到的乳状溶液在50-65℃下搅拌5-15min，反应结束后离心分离，沉淀分散在1-5mLpH＝7.4的PBS缓冲液中，得到水解后的PSIOAm溶液。进一步地，水解后的PSIOAm的浓度为1～10mg/mL。水解后的PSIOAm溶液、羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白的比值为(1-10)mL：(0.1-1)g：(0.1-1)g：(1-10)mg：(1-10)mg。所述步骤b具体包括以下步骤：b-1、首次免疫：将PSIOAm免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合后，背部皮下多点注射到动物体内，注射8～10个点，注射量为1mL/只；b-2、加强免疫：将PSIOAm免疫原与福氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到动物体内，注射量为1mL/只；此后每隔一周再进行一次加强免疫，期间采血测效价，直到抗体效价达到1:32000，进行最后一次加强免疫，从动物颈动脉采血，取血清部分制得PSIOAm抗体。所述步骤c具体包括以下步骤：c-1、包被：用包被缓冲液将PSIOAm包被抗原稀释100倍，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃冰箱过夜；c-2、封闭：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，然后加入1wt％酪蛋白封闭，每孔200μL，37℃温育1～2h；PBST溶液洗涤的目的是洗去未被结合上的PSIOAm包被抗原；c-3、加样竞争：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，然后将50μL不同浓度的PSIOAm标准液和50μLPSIOAm抗体分梯度加入各孔中，37℃温育1～2h，PBST溶液洗涤的目的是洗去多余的封闭液；c-4、加酶：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，然后每孔加入100μLPBS稀释的稀释比为1/1000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，37℃温育2～4h；PBST溶液洗涤的目的是洗去未被结合的游离态的PSIOAm标准液或PSIOAm抗体；c-5：显色:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，然后每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应，37℃温育0.5～1h；PBST溶液洗涤的目的是洗去未被酶标板结合的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体；c-6、终止：每孔加入50μL2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值。本专利技术提供了一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺(PSIOAm)高分子纳米药物载体的方法，利用酶联免疫分析技术中的间接竞争酶联免疫法，通过PSIOAm抗体的制备，利用抗原抗体的特异性结合定量地检测了PSIOAm的浓度。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)利用机体的免疫应答效应，成功的制备出特异性高的PSIOAm多克隆抗体，抗体的保质期较长，因此，可行性高。(2)利用酶联免疫分析技术中的间接竞争酶联免疫法对PSIOAm的浓度进行了定量检测，该方法的专利技术为今后纳米药物载体的定量检测提供了一种可行性较高的方法。(3)该方法操作简单，可行性高，灵敏度高，检出限低。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺接枝聚琥珀酰亚胺(PSI

【技术特征摘要】
1.一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺接枝聚琥珀酰亚胺(PSIOAm)高分子纳米药物载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a、制备PSIOAm包被抗原和免疫原；b、制备PSIOAm抗体：c、将PSIOAm包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的PSIOAm标准液，以PSIOAm抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗，进行间接竞争酶联免疫分析法；d、以PSIOAm标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，从而定量检测出PSIOAm的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性方程为A＝1.256-0.148lgC，其中A为490nm处吸光度值，C为PSIOAm浓度。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a具体包括以下步骤：a-1、水解PSIOAm，得到水解后的PSIOAm溶液；a-2、向水解后的PSIOAm溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和牛血清白蛋白，20-30℃温育3-6小时后，离心分离，取沉淀分散于pH＝7.4的PBS缓冲液中即得到PSIOAm免疫原溶液；a-3、向水解后的PSIOAm溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和鸡卵清白蛋白，20-30℃温育3-6小时后，离心分离，取沉淀分散于pH＝7.4的PBS缓冲液中即得到PSIOAm包被抗原溶液；a-4、将PSIOAm免疫原溶液和PSIOAm包被抗原溶液分别置于透析袋中，以pH＝7.4的PBS缓冲液透析12-16h后收集，即可得到PSIOAm免疫原和PSIOAm包被抗原。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a-1具体包括以下步骤：将浓度为60mg/mL的油胺接枝聚琥珀酰亚胺的三氯甲烷溶液0.1-0.5mL，分散在1-6mL0.1-1mmol/LNaOH中，超声5-10min，得到的乳状溶液在50-65℃下搅拌5-15min，反应结束后离心分离，沉淀分散在1-5mLpH＝7.4的PBS缓冲液中，得到水解后的PSIOA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明翠，曹以婷，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34