一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法，包括以下步骤：步骤1：样品溶液制备：将乌榄叶干燥粉碎后，对粉粹后的乌榄叶进行超声提取后定容过滤得到样品溶液；步骤2：制备对照品溶液；所述的对照品溶液中含有已知量的绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素；步骤3：色谱分析：将样品溶液、对照品溶液经过高效液相色谱法分析后即可计算得到绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素在乌榄叶中的含量。本发明专利技术的目的在于提供一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法，可更为直观快速有效地测定乌榄叶的主要活性成分，检测精度和准确性高，重复性好，为乌榄叶的进一步开发提供有力的科学依据。

A method for simultaneous determination of six components in leaves of Canarium pimela Koening content

The invention discloses a method for the simultaneous determination of six components in leaves of Canarium pimela Koening content, which comprises the following steps: Step 1: sample solution preparation: Canarium pimela leaf after drying and crushing, ultrasonic extraction of pure powder of Canarium pimela leaf after constant volume filtered to obtain sample solution; step 2: preparation of the reference solution; the reference solution containing a known amount of chlorogenic acid in the, Vitexin, isovitexin, hyperin, rutin and quercetin; step 3: chromatographic analysis: the sample solution and the reference solution by HPLC analysis method can calculate chlorogenic acid, Vitexin, isovitexin, hyperin, rutin and quercetin in leaves of Canarium pimela. The aim of the invention is to provide a method for the simultaneous determination of six components in leaves of Canarium pimela Koening content, can be more intuitive as the main active ingredient effectively determination of Canarium pimela leaf, detection accuracy and high accuracy, good repeatability, provide the scientific basis for the further development of Canarium pimela leaf.

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法
本专利技术涉及乌榄叶的测定领域，具体涉及一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法。
技术介绍
乌榄(CanariumpimelaLeenh.)又名黑橄榄，木威子，是木本油料兼果用常绿乔木树种，在植物分类上属于橄榄科橄榄属，原产于我国华南地区，广泛分布于越南等东南亚国家，其根、叶、种仁均可入药，民间常将其用于治疗风湿腰腿痛、手足麻木、胃痛、汤火伤。乌榄叶简单易得，经济效益高。本课题组前期研究中，通过大鼠离体血管环灌流、颈动脉插管和离体心脏灌流等方法，发现乌榄叶提取液具有快速短效的降压作用，且其降压效果与持续时间随着药物剂量的增大而提高且延长；同时其还具有明显的减慢心率、稳定和增加冠脉流量等心血管方面的作用。研究结果提示乌榄叶提取液中存在具有作用于心血管的活性物质，而在成分分析方面，已有的对乌榄叶的研究报道主要在挥发油上，而其他化学成分研究暂未见相关报道，物质基础存在大片空白。此外，国内外大量的研究表明绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素均具有抗氧化、抗癌、保护心血管系统等生物活性，具有潜在的良好应用前景。在含量测定方面，目前尚未公开记载同时测定绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素这六种成分含量的高效液相色谱法。
技术实现思路
本专利技术公开了一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法，具体来说，该六种成分为绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素，本专利技术的方法可更为直观快速有效地测定乌榄叶的主要活性成分，检测精度和准确性高，重复性好，为乌榄叶的进一步开发提供有力的科学依据。本专利技术提供的一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法，包括以下步骤：步骤1：样品溶液制备：将乌榄叶干燥粉碎后，对粉粹后的乌榄叶进行超声提取后定容过滤得到样品溶液；步骤2：制备对照品溶液；所述的对照品溶液中含有已知量的绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素；步骤3：色谱分析：将样品溶液、对照品溶液经过高效液相色谱法分析后即可计算得到绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素在乌榄叶中的含量；其中，高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C-18色谱柱，250*4.6mm，5μm；流速为1mL/min；检测波长为360nm；柱温为30℃；进样体积为20μL；流动相为甲醇-0.4％磷酸，梯度洗脱；采用外标法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按绿原酸峰计算，不低于8000。需要说明的是，上述的步骤1具体为：将乌榄叶干燥粉碎，过二号筛；精密称定乌榄叶粉末0.5g于具塞锥形瓶中，精密加入体积百分数为50％的甲醇水溶液50mL，密塞浸泡30min后超声30min，静置冷却；加入体积百分数为50％的甲醇水溶液补足失重，摇匀，过滤；取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得样品溶液。需要说明的是上述的步骤2具体为：精密称定绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素对照品适量，加入体积百分数为50％的甲醇水溶液超声溶解，定容摇匀，即得混合对照品溶液。需要说明的是，上述的梯度洗脱的具体方法为：0～8min，甲醇的体积百分数为23％～32％的甲醇-0.4％磷酸溶液；8～30min，甲醇的体积百分数为32％～35％的甲醇-0.4％磷酸溶液；30～50min，甲醇的体积百分数为35％～70％的甲醇-0.4％磷酸溶液；50～55min，甲醇的体积百分数为70％～23％的甲醇-0.4％磷酸溶液；55～60min，甲醇的体积百分数为23％～23％的甲醇-0.4％磷酸溶液。需要说明的是，上述的C-18色谱柱为ZorbaxSB-C18色谱柱。需要说明的是，上述的高效液相色谱仪的型号为DionexUltiMate3000高效液相色谱仪和Agilent1260高效液相色谱仪；所述的电子天平的型号为BSA224S电子天平，购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；超声波清洗器的型号为KQ-300DA超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。需要说明的是，所述的对照品芦丁(Rutin，批号100080-201409，纯度91.9％供HPLC测定)和槲皮素(Quercetin，批号100081-201408，纯度99.1％供HPLC测定)购自中国食品药品检定研究院。需要说明的是，所述的绿原酸(Chlorogenicacid，批号PCS0348-150511，纯度99.37％)、牡荆素(Vitexin，批号PCS0646-151102，纯度98.84％)、异牡荆素(Isovitexin，批号PCS0647-151204，纯度98.47％)和金丝桃苷(Hyperin，批号PCS0522-150615，纯度98.28％)均购自成都植标化纯生物技术有限公司。需要说明的是，所述的乌榄叶药材采摘自广东省中山市，由广东药科大学中药标本馆刘基柱教授鉴定为橄榄科橄榄属乌榄的干燥叶子。需要说明的是，所述的甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国LABSCIENCE公司，水为超纯水，购自Watson公司；磷酸为分析纯，购自天津市致远化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。本专利技术与传统方法相比，具有以下优点：1.本专利技术借助超高效液相-质谱联用技术(UPLC/MS)，采用对照品比对，Scifinder、chemspider和Massbank等数据库检索，从乌榄叶中首次鉴定出了包括绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素等酚酸类成分。通过聚酰胺树脂粗分，收集含有绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素成分的洗脱液并进行离体动物实验，发现其具有舒张大鼠胸主动脉平滑肌的作用。2.六个成分分离效率高，均能达到基线分离；3.在线性范围内，6个成分的线性关系良好，加样回收率和相对标准偏差均符合《中国药典》相关规定，表明该方法具有良好的可靠性和准确性。4.日内精密度、日间精密度、重复性和中间精密度均能达到药典相关规定的要求。5.本方法首次建立同时测定绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素六个成分的高效液相色谱法，并成功用于快速检测其在乌榄叶中的含量，可更加直观快速评价乌榄叶的质量，为乌榄叶的进一步开发提供有力的科学依据。附图说明图1是本专利技术实施例1的绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素混合对照品溶液的高效液相色谱图；图2是本专利技术实施例1的乌榄叶提取液的高效液相色谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本专利技术的权利要求做进一步的详细说明，但并不构成对本专利技术的任何限制，任何人在本专利技术权利要求保护范围之内所做的有限次的修改，仍在本专利技术权利要求保护范围之内。实施例11样品溶液制备将乌榄叶干燥粉碎，过二号筛。精密称定乌榄叶粉末0.5g于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液(V/V)50mL，密塞浸泡30min后超声30min，静置冷却，称重。加入50％甲醇水溶液(V/V)补足失重，摇匀，过滤。取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得样品溶液。2.对照品溶液制备精密称定绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素对照品适量，加入50％甲醇水溶液(V/V)超声溶解，定容摇匀，即得混合对照品溶液。3.色谱条件色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)；流速为1mL/min；检测波长为360n本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：样品溶液制备：将乌榄叶干燥粉碎后，对粉粹后的乌榄叶进行超声提取后定容过滤得到样品溶液；步骤2：制备对照品溶液；所述的对照品溶液中含有已知量的绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素；步骤3：色谱分析：将样品溶液、对照品溶液经过高效液相色谱法分析后即可计算得到绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素在乌榄叶中的含量；其中，高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C‑18色谱柱，规格为250*4.6mm，5μm；流速为1mL/min；检测波长为360nm；柱温为30℃；进样体积为20μL；流动相为甲醇‑0.4％磷酸，梯度洗脱；采用外标法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按绿原酸峰计算，不低于8000。

【技术特征摘要】
2016.09.28 CN 20161086223271.一种同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：样品溶液制备：将乌榄叶干燥粉碎后，对粉粹后的乌榄叶进行超声提取后定容过滤得到样品溶液；步骤2：制备对照品溶液；所述的对照品溶液中含有已知量的绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素；步骤3：色谱分析：将样品溶液、对照品溶液经过高效液相色谱法分析后即可计算得到绿原酸、牡荆素、异牡荆素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素在乌榄叶中的含量；其中，高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C-18色谱柱，规格为250*4.6mm，5μm；流速为1mL/min；检测波长为360nm；柱温为30℃；进样体积为20μL；流动相为甲醇-0.4％磷酸，梯度洗脱；采用外标法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按绿原酸峰计算，不低于8000。2.根据权利要求1所述的同时测定乌榄叶中六种成分含量的方法，其特征在于，所述的步骤1具体为：将乌榄叶干燥粉碎，过二号筛；精密称定乌榄叶粉末0.5g于具塞锥形瓶中，精密加入体积百分数为50％的甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕竹芬，董艳芬，梁燕玲，方小爱，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44