一种蝉花的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种蝉花的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a，色谱条件：以乙腈-磷酸二氢盐溶剂系统为流动相，等度洗脱；步骤b，对照品溶液的制备：取腺苷对照品，加溶剂制成对照品溶液；步骤c，供试品溶液的制备：取蝉花待测样品，加溶剂提取制得供试品溶液；和步骤d，测定：分别吸取对照品与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。本发明专利技术方法可用于蝉花子实体、孢子粉、菌质或上述物质的提取物或制剂的检测，方法简便干扰较少且稳定性好。

Method for detecting cicada flower

The invention relates to a cicada detection method, the method of HPLC, characterized by comprising the following steps: step a, chromatographic conditions: in solvent system of acetonitrile phosphate as mobile phase, isocratic elution; step B, standard solution preparation of adenosine: take control, and solvent control solution; step C for sample preparation: take samples for cicada flower extraction with solvent prepared sample solution; and step D, respectively: control and determination to learn the testsolution injection, HPLC, determination. The method of the invention can be used for the flower entity, spore powder, bacteria matter or the substance or preparation of the extract detection method is simple, less interference and good stability.

【技术实现步骤摘要】
一种蝉花的检测方法
本专利技术涉及一种中药的检测方法，特别涉及一种蝉花的检测方法。
技术介绍
蝉花(IsariacicadaeMiquel)属于真菌界、子囊菌门、盘菌亚门、粪壳菌纲、肉座菌目、虫草科、棒束孢属(Isaria)。蝉花是我国名贵的中药材，是寄生在蝉(俗称“知了”)上的一种虫草菌。其药用已有1000多年历史，是我国传统的名贵药材之一，具有多方面的药用价值。主要成分有：腺苷、虫草多糖、虫草酸(甘露醇)、虫草素、尿嘧啶、甾醇、生物碱、维生素、无机盐、矿物质元素等。蝉花具有调节人体免疫的功能，提高食欲，促进睡眠，增强自身抗病的能力。在这些成分当中，虫草多糖具有独特的生物活性，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等功效，免疫调节作用成为研究开发的热点。腺苷能抑制中枢神经元的兴奋性，可以扩张冠状及周围血管、增加冠状动脉血流量、降低血压、减慢心率等作用。腺苷还具有抗血小板聚集、抗辐射和抗肿瘤等作用。不仅如此，蝉花中的活性成分ISP-1具有双向免疫调节活性，可以大大的提高器官移植手术的成功率，对患者的康复也有着明显的积极效果。目前，国内已有一些对腺苷含量测定的报道。如《中华人民共和国药典》2010版第一部及《保健食品检验与评价技术规范》中华人民共和国卫生部2003版均有涉及，但本专利专利技术人在进行蝉花样品腺苷测定的验证试验时发现上述方法腺苷的提取及处理方法会导致腺苷的提取率偏低且干扰较多。因此本专利对样品的提取及处理方法等进行了改进。改进后腺苷的提取率提高数倍，不仅方法简单方便干扰较少，而且可以适用于蝉花子实体(孢梗束)、蝉花孢子粉、蝉花菌质等蝉花各个部位及其相关制剂，结果令人满意。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蝉花的检测方法。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：一种蝉花的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，包括如下步骤：步骤a，色谱条件：以乙腈-磷酸二氢盐溶剂系统为流动相，等度洗脱；步骤b，对照品溶液的制备：取腺苷对照品，加溶剂制成对照品溶液；步骤c，供试品溶液的制备：取蝉花待测品，加溶剂提取制得供试品溶液；和步骤d，测定：分别吸取对照品与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。进一步，步骤a流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝(5-15):(85-95)；更进一步，流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝(5-10):(85-90)；更进一步，流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝5:95。进一步，步骤a所述磷酸二氢盐溶液浓度为0.02～0.05mol/L；更进一步，为0.04mol/L；更进一步，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。进一步，步骤b所述溶剂为体积分数为20％～50％甲醇水溶液。进一步，步骤b所述对照品溶液的浓度为20～30μg/mL。进一步，步骤c所述提取溶剂为水。进一步，步骤c加水提取后，提取液加入甲醇；更进一步，甲醇加入量为至甲醇含量达到20％～50％；更进一步，至甲醇含量达到30％～50％；更进一步，至甲醇含量达到40％～50％；更进一步，至甲醇含量达到50％；所述百分比为体积百分比。进一步，步骤c所述提取方法为加热提取、回流提取或超声提取。更进一步，步骤c供试品溶液的制备方法为：取蝉花待测品，加入20～30倍量(g/mL)的水超声提取，提取液加甲醇至甲醇含量为50％，过滤，取续滤液即得。进一步，该检测方法的检测波长为200～300nm；更进一步，检测波长为260nm。进一步，该检测方法的流动相流速为0.5～2mL/min-1，柱温30～40℃；更进一步，该检测方法的流动相流速为1mL/min-1，柱温35℃。进一步，步骤c所述蝉花待测样品为蝉花子实体、蝉花孢子粉或蝉花菌质中的任意一种，或以任意一种上述物质为原料经提取得到的提取物，或提取物经精制纯化得到的有效部位，或提取物/有效部位按常规制剂工艺制成的临床上可接受制剂。其中，所述提取方法为本领域常规提取方法，如浸渍提取、超声提取、回流提取、渗漏提取等；所述精制纯化工艺包括萃取、过大孔树脂柱、凝胶柱、反向色谱柱等；所述制剂包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂等制剂。附图说明图1流动相为甲醇-水梯度洗脱的色谱图；图1A：流动相为甲醇-水梯度洗脱的对照品的液相色谱图；图1B：流动相为甲醇-水梯度洗脱的供试品的液相色谱图；图2流动相为甲醇-水梯度洗脱的色谱图；图2A：流动相为甲醇-水梯度洗脱的对照品的液相色谱图；图2B：流动相为甲醇-水梯度洗脱的供试品的液相色谱图；图3流动相为甲醇-水(1:9)等度洗脱的色谱图；图3A：流动相为甲醇-水(1:9)等度洗脱的对照品的液相色谱图；图3B：流动相为甲醇-水(1:9)等度洗脱的供试品的液相色谱图；图4流动相为甲醇-乙腈-水(5:5:90)等度洗脱的色谱图；图4A：流动相为甲醇-乙腈-水(5:5:90)等度洗脱的对照品的液相色谱图；图4B：流动相为甲醇-乙腈-水(5:5:90)等度洗脱的供试品的液相色谱图；图5流动相为乙腈-水梯度洗脱的色谱图；图5A：流动相为乙腈-水梯度洗脱的对照品的液相色谱图；图5B：流动相为乙腈-水梯度洗脱的供试品的液相色谱图；图6流动相为乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾溶液(5:95)等度洗脱的色谱图；图6A：流动相为乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾溶液(5:95)等度洗脱的对照品的液相色谱图；图6B：流动相为乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾溶液(5:95)等度洗脱的供试品的液相色谱图；图7标准曲线图；图8实施例8蝉花子实体的色谱图；图9实施例8蝉花孢子粉的色谱图；图10实施例8蝉花菌质的色谱图；图11～19实施例9、13～20的色谱图实验例1流动相的筛选1、仪器和材料1.1仪器WatersSymmetryC185μm4.6*250mm；Waters高效液相色谱仪(1525二元高压泵；2998二极管阵列检测器；2707自动进样器；Empower2操作软件)。SB25-12DT超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；MilliporeSimplicity超纯水仪(美国Millipore公司)；H1650台式高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；1.2试剂乙腈(HPLC级，4L/瓶，LOT116824，Fisher)；甲醇(HPLC级，4L/瓶，LOT120511，Fisher)；甲醇(AR，500mL/瓶，20120627，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(AR，500mL/瓶，20120111，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸(AR，500mL/瓶，T20100416，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(AR，500g/瓶，F20100413，国药集团化学试剂有限公司)；腺苷标准品(20mg/支，110879-200202，中国食品药品检定研究院)；屈臣氏蒸馏水(4.5L/瓶，20111116，上海加州斯帕克林饮用水有限公司)；1.3实验材料蝉花子实体[所述蝉花已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCCNo.3453]。2、方法与结果2.1色谱及检测条件流动相：①甲醇-水梯度洗脱，甲醇10％→100％；②甲醇-水梯度洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蝉花的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a，色谱条件：以乙腈‑磷酸二氢盐溶剂系统为流动相，等度洗脱；步骤b，对照品溶液的制备：取腺苷对照品，加溶剂制成对照品溶液；步骤c，供试品溶液的制备：取蝉花待测样品，加溶剂提取制得供试品溶液；和步骤d，测定：分别吸取对照品与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。

【技术特征摘要】
1.一种蝉花的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a，色谱条件：以乙腈-磷酸二氢盐溶剂系统为流动相，等度洗脱；步骤b，对照品溶液的制备：取腺苷对照品，加溶剂制成对照品溶液；步骤c，供试品溶液的制备：取蝉花待测样品，加溶剂提取制得供试品溶液；和步骤d，测定：分别吸取对照品与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a所述流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝(5-15):(85-95)。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a所述流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝(5-10):(85-90)。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a所述流动相比例为乙腈：磷酸二氢盐溶液＝5:95。5.如权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张忠亮，王玉芹，刘艳菊，尹彬，陈桃宝，胡建峰，施伟勤，顾玲玲，徐煜，孙长胜，
申请(专利权)人：浙江泛亚生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33