检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法技术

一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法，属于生物传感器技术领域。识别元件是单链DNA适配体，含有38个碱基，5’端修饰‐SH‐(CH

Aptamer electrochemical biosensor and its preparation method for the detection of malachite green

Aptamer electrochemical biosensor and its preparation method for detecting malachite green, which belongs to the technical field of biological sensors. The recognition element is a single stranded DNA aptamer, containing 38 nucleotides, 5 'end modified SH (CH

【技术实现步骤摘要】
检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法
本专利技术属于生物传感器
，特别涉及一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法。可以用于渔业生产中孔雀石绿的检测。
技术介绍
孔雀石绿(Malachitegreen,简称MG)，属三苯甲烷类染料，其代谢为无色孔雀石绿，长期以来，由于孔雀石绿在水产养殖中具有良好的抗真菌病，水产品保鲜以及价格低廉等优点，因此，成为许多养殖户青睐的“渔药”来使用，但这两种物质均具有高毒素、高残留和高致畸、致突变等副作用，已成为重大的食品安全隐患。目前，孔雀石绿被我国列为禁用渔药，现有的测定方法主要有高效液相色谱法、气质联用法、液质联用法等。这些方法有操作繁琐、仪器价格昂贵，需要专业的技术人员，而且不适合现场大规模的检测等缺点。而现场常使用商品化酶联免疫试剂盒法检测孔雀石绿，但容易产生假阳性结果。因此，我国急需建立一种准确、快速、便携、简单操作的检测孔雀石绿的方法近年来，适配体(aptamer)作为识别元件特异性识别小分子的生物传感器成为研究热点，主要是其识别元件较稳定，受环境干扰和限制比较少，易于合成等方面的优势。目前，已有两个专利公开了两种适配体型检测孔雀石绿的方法。其中，公开专利(申请号为200710070381.0)一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法，利用特定序列的单链DNA为适配体，采用酶联显色法检测，但其酶联法易产生结果假阳性的问题没有解决。另一个，公开专利(申请号为201410008020.3)一种通过电化学适配体传感器来检测孔雀石绿的方法，采用特定序列RNA为识别元件，通过适配体和目标物的结合作用把目标物结合到电极表面，然后在结合上目标物的抗体，构成夹心结构；电化学方法避免了一定程度在检测中的假阳性问题，但是该专利中抗体制备需要动物性实验时间长，也比较困难；更主要的RNA适配体价格昂贵、不稳定而且标记相当困难，这也限制了RNA适配体在检测孔雀石绿方面的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法，解决了检测结果易出现假阳性的问题，并大幅降低了成本。针对现有的技术的不足，提供一种快速、简单、准确、成本低可用于水溶液中孔雀石绿检测的适配体型电化学生物传感器及其制备方法。一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，包括识别元件和换能器；识别元件是单链DNA适配体，序列为GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38个碱基，5’端修饰‐SH‐(CH2)6‐，在3’端修饰电活性物质亚甲基蓝(MB)作为信标分子；换能器为常用的电化学型换能器，工作电极为修饰有上述孔雀石绿单链DNA适配体的金电极，对电极为Pt，参比电极为Ag/AgCl；检测底液为磷酸盐缓冲溶液。其检测原理是：加入孔雀石绿靶分子之前信标分子MB距离电极表面较远，电子转移较慢，MB电化学信号响应较小，加入孔雀石绿后与单链DNA适配体相互作用形成茎环，MB与电极表面之间的距离被拉近，其电化学信号增加，通过电化学信号的变化，实现对孔雀石绿的检测。图1给出单链DNA适配体和孔雀石绿相互作用的紫外‐可见光谱图。从图1中可以看出，在波长范围为220～320nm区间，单链DNA适配体本身在260nm处有一个吸收峰。当加入孔雀石绿靶分子后，该吸收峰降低，说明两种存在着相互作用。一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器的制备方法，具体步骤及参数如下：1、金电极的抛光及活化处理：将金电极在抛光布上用氧化铝粉末打磨，用乙醇和超纯水分别超声清洗，然后在硫酸溶液中电化学扫描活化，超纯水冲洗后，用氮气吹干待用；2、适配体溶液的配制：将单链DNA适配体冷冻液，先涡旋1～3min，使其能够均匀分散，用超纯水配制浓度为3.3～10μmolL-1的适配体溶液；单链DNA适配体：序列为GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38个碱基，5’端修饰‐SH‐(CH2)6‐，在3’端修饰电活性物质亚甲基蓝(MB)作为信标分子；3、修饰电极的制备：取5～10μL步骤2中配制的适配体溶液，滴在步骤1活化后的金电极表面，将电极置于4℃的冰箱中组装12～16h，用蒸馏水洗去非特异性吸附的适配体，然后用于检测，不使用时，在冰箱4℃下保存。上述传感器建立标准曲线的步骤为：1、以上述修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt为对电极，磷酸缓冲液为检测底液，采用差分脉冲伏安法(DPV)来检测，扫描电位范围为0.2～-0.5V，振幅为0.05V，以MB作为信标分子，记录其DPV谱图，得到MB的还原峰电流值，作为空白时的电流响应I0。磷酸缓冲液的pH值为6.0～8.0，浓度为0.05～0.1molL-1。2、将修饰电极依次浸入含有孔雀石绿标准品的检测底液中，在浓度为1×10‐1～1×104pgL-1的各个数量级分别选取1-2个测试点，各浓度在室温下孵育100～600s，接下来记录工作电极的DPV曲线，其测试条件同步骤1，得到在不同浓度孔雀石绿的MB的DPV谱图以及相应的还原峰电流值Ip，并计算不同浓度的孔雀石绿相对于初始适配体传感器峰电流的相对变化差值ΔI＝Ip‐I0。3、以孔雀石绿标准品水溶液浓度的对数值lgC为横坐标，ΔI为纵坐标作图，建立标准曲线。根据标准曲线，可应用于未知水样中孔雀石绿的检测。本专利技术的效果为，利用本专利技术所述的孔雀石绿适配体电化学生物传感器其线性范围可跨越为5个数量级，检测限最低可达0.08pgL‐1，比目前所报道的孔雀石绿的检测限都要低。本专利技术的优点在于，解决了现有的检测孔雀石绿的检测成本高，检测方案复杂，准确度不高等缺点，提供了一种检测快速，成本低，操作简便、易于便携的孔雀石绿适配体电化学生物传感器及其制备方法。该孔雀石绿适配体价格经济、易于标记，传感器的制备程序和检测方法简单，具有线性范围宽和检测限低等优点，可应用于水体中现场准确、快速和高灵敏地检测孔雀石绿。附图说明图1为孔雀石绿适配体aptamer及其与靶分子孔雀石绿结合aptamer‐MG后的紫外‐可见吸收光谱图。图2为实施例1中孔雀石绿适配体电化学生物传感器在不同浓度的孔雀石绿标准溶液中的差分脉冲伏安谱图。图3为实施例1中裸金电极(Au)，修饰适配体后的金电极(aptamer‐Au)以及该修饰电极结合孔雀石绿后的电极(MG‐aptamer‐Au)在5mmolL‐1的铁氰化钾溶液中的循环伏安谱图。图4实施例1中生物传感器对孔雀石绿检测的标准曲线图。具体实施方式：下面结合具体实施例对本专利技术作详细说明，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，包括识别元件和换能器；识别元件是单链DNA适配体，序列为GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38个碱基，5’端修饰‐SH‐(CH2)6‐，在3’端修饰电活性物质亚甲基蓝(MB)作为信标分子；换能器为常用的电化学型换能器，工作电极为修饰有上述孔雀石绿单链DNA适配体的金电极，对电极为Pt，参比电极为Ag/AgCl；检测底液为磷酸盐缓冲溶液。一种检测孔雀石绿的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，包括识别元件和换能器，其特征在于，识别元件是单链DNA适配体，序列为GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38个碱基，5’端修饰‐SH‐(CH

【技术特征摘要】
1.一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，包括识别元件和换能器，其特征在于，识别元件是单链DNA适配体，序列为GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38个碱基，5’端修饰‐SH‐(CH2)6‐，在3’端修饰电活性物质亚甲基蓝MB作为信标分子；换能器为常用的电化学型换能器。2.一种权利要求1所述传感器的制备方法，具体步骤及参数如下：1)金电极的抛光及活化处理：将金电极在抛光布上用氧化铝粉末打磨，用乙醇和超纯水分别超声清洗，然后在硫酸溶液中电化学扫描活化，超纯水冲洗后，用氮气吹干待用；2)适配体溶液的配制：将单链DNA适配体冷冻液，先涡旋1～3min，使其均匀分散，用超纯水配制浓度为3.3～10μmolL-1的适配体溶液；3)修饰电极的制备：取5～10μL步骤2)中配制的适配体溶液，滴在步骤1)活化后的金电极表面，将电极置于4℃的冰箱中组装12～16h，用蒸馏水洗去非特异性吸附的适配体，然后用于检测。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的单链DNA适配体：序列为GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38个碱基，5’端...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈旭，朱万军，吴立冬，付啸辰，杨文胜，
申请(专利权)人：北京化工大学，中国水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11