一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，先制备梯度聚丙烯酰胺凝胶两块，按常规方法配制浓缩胶，不加梳子，制得两块相同的凝胶板块；然后将2块分别插进完全相同的两个电泳槽中，在向每个电泳槽加预处理好的尖吻蝮蛇毒，其中一块电泳板正常电泳，另一块电泳板正、负极对调，二块板同时电泳，正常电泳板中溴酚蓝到达凝胶底部后，电泳同时结束，取下两块凝胶先染色在用蒸馏水脱色，直到清晰地出现蛋白质蓝色条带为止，将每个蛋白质条带切割下来，加人生理盐水于研钵中磨细，再注射到小鼠腹部皮下，1h后解剖，观察有几条出血明显的条带，即表示尖吻蝮蛇含多少种出血毒素。本发明专利技术方法检测过程方便、结果稳定，检测时间短。

A simple method for identification of Agkistrodon acutus venom hemorrhagic toxin species

The invention discloses a simple method for identification of Agkistrodon acutus venom hemorrhagic toxin species, the first preparation of gradient polyacrylamide gel two, concentrated gum prepared by conventional methods, without comb, prepared two pieces of the same gel plate; then 2 blocks are respectively inserted into two identical electrophoresis tank, in to each tank with pretreatment of Agkistrodon acutus venom, which a normal electrophoresis electrophoresis, another block electrophoresis plate, anode exchange, two plates and normal plate electrophoresis, electrophoresis of bromophenol blue gel after electrophoresis at the bottom, at the same time, take two pieces of gel with distilled water in dyeing decolorization, until clear protein bands blue, each band cut into saline ground in a mortar, and then injected into mice abdominal subcutaneous dissection after 1h, there are several observation, bleeding The obvious band indicates how many kinds of bleeding toxins are there in the pit viper?. The method of the invention has the advantages of convenient detection process, stable result and short detection time.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法
一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，属于生物化学领域。
技术介绍
尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)俗称五步蛇,属于蝮亚科、蝮属，分布于我国长江以南地区（包括台湾），是我国特有剧毒蛇。该蛇毒为血循环型毒蛇,其主要毒素为出血毒素，前人从不同产地的尖吻蝮蛇毒中分离出不同种类的出血毒素，有人从皖南产尖吻蝮蛇毒中分离出至少4种低分子量出血毒素，分别命名为出血毒素Ⅰ（AaHⅠ）、出血毒素Ⅱ（AaHⅡ）、出血毒素Ⅲ（AaHⅢ）和出血毒素Ⅳ（AaHⅣ）；有人从湖南尖吻蝮蛇毒中分离出3种出血毒素，分别命名为DaHT-1、DaHT-2和DaHT-3。有人从福建产尖吻蝮蛇毒中分离出1种出血毒素，命名为AA-MP-I。有人分别从台湾产尖吻蝮蛇毒中纯化出5种出血毒素，分别命名为AC-1、AC-2、AC-3、AC-4和AC-5。产地不同、甚至不同环境、不同生长阶段的尖吻蝮蛇产生的出血毒素种数都不同，确定出血毒素的种数是研究出血毒素的一项基础工作。
技术实现思路
本专利技术提供了一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简单方法。本专利技术方法利用现有的染色试剂盒并进行改良，找出一种鉴定尖吻蝮蛇出血毒素种数的简单方法。本专利技术使用的试剂盒为生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（ProteinStainsH，产品编号：C510041）”，该试剂盒由染色液A、染色液B和脱色液组成，染色液A含考马斯亮蓝R-250，染色液B含离子对，可使考马斯亮蓝R-250与蛋白质的结合较快，而与胶的结合程度较低，染色液A、染色液B混合后组成染色液，染色液能够快速与蛋白质结合，与凝胶结合疏松，染色后保留蛇毒蛋白的原有活性，因试剂盒中的脱色液含乙酸和甲醇，乙酸和甲醇是蛋白质的变性剂，本专利技术不用。本专利技术用染色液A和染色液B组成的混合液染色，用蒸馏水脱色，确保蛇毒蛋白保存原有的活性。具体方案如下：一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，其特征在于，包括以下步骤：a、制备梯度聚丙烯酰胺分离胶二块，凝固后的胶从上到下浓度逐渐增大，凝胶的孔径逐渐减小，按常规方法配制浓缩胶，上端留1cm的空间作为加样品的空间，不加梳子；b、将制好的电泳板，每个电泳槽加浓度40-60mg/mL尖吻蝮蛇毒1.0mL，一块电泳板正常电泳（酸性蛋白质进入凝胶），另一块电泳板正、负极对调（碱性蛋白质进入凝胶），二块板同时电泳，正常电泳板中溴酚蓝到达凝胶底部后，电泳同时结束，取下凝胶，放塑料盒中待染色；c、用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（产品编号：C510041）”染色，染色时间从30分钟缩短为6分钟，用蒸馏水脱色代替试剂盒中的脱色液，直到清晰地出现蛋白质蓝色条带为止；d、对每个蛋白质条带，用手术刀切下约2.5cm蛋白条带，加0.2mL生理盐水于研钵中磨细，将凝胶悬浮液注射到小鼠腹部皮下，1h后解剖观察是否出血，出血明显的条带既为一种出血毒素，总共有多少出血明显出血条带表示尖吻蝮蛇毒含多少种出血毒素。本专利技术技术效果体现在几个方面：1、利用试剂盒，不需要配试剂，检测过程方便、结果稳定。本专利技术用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（ProteinStainsH，产品编号：C510041）”，只是在染色时间和脱色方面做些修改，因此不需要配试剂，检测过程方便、结果稳定。2、检测时间短，整个过程仅仅需要2天就可以完成检测工作；3、可以推广到其他含出血毒素的动物毒素的检测上。具体实施方式实施例一：一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，包括以下步骤：第一步：5-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）的制备将5%胶和20%胶按比例配制（表1）后分别倒入剃度仪的A管和B管，打开磁力搅拌器，开通A管和B管之间的连接通道，开启恒流泵，以恒定流速将逐步混合的胶从B管泵入凝胶槽内，完毕后加异丙醇封闭，凝固后的胶从上至下浓度逐渐增大（5-20%），孔径逐渐减小，按常规方法配制浓缩胶，不需要不加梳子，上面留1cm空间加蛇毒样品，凝固后制得凝胶板，同样的方法制2块凝胶板，表15-20%SDS-PAGE梯度胶第二步：制备电泳分离尖吻蝮蛇毒取尖吻蝮蛇原毒，配制成50mg/mL浓度，13000转/分钟离心6分钟去除不溶物，由于蛇毒蛋白质种类较多，既含酸性蛋白，也含碱性蛋白，电泳液的pH为8.3，在此pH条件下，等电点小于8.3的蛋白质正常的往正极移动，而等电点大于8.3的蛋白质不能进入凝胶，而向负极的电泳缓冲液移动，对于这部分碱性蛋白采用调换正、负极的方法使其进入凝胶中，因此本专利技术用二块凝胶板同时电泳，每个电泳槽加1.0mL蛇毒溶液。正常电泳板（电泳酸性蛋白质）溴酚蓝到达凝胶底部后，电泳同时结束，取下凝胶，放塑料盒中待染色；第三步：染色与脱色本专利技术用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（ProteinStainsH，产品编号：C510041）”，试剂盒包含染色液A、染色液B和脱色液。染色液A主要含考马斯亮蓝R-250，染色液B含离子对，使得考马斯亮蓝R-250与蛋白质的结合较快，而与胶的结合程度较低，使用中取一倍浓度染色液A20mL加1.2mL染色液B混合，取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶，每次加入200mL蒸馏水，置于摇床上，震荡清洗5min，重复3次，加入60mL染色混合液，置于摇床上，震荡染色6min，倒掉染色液后用200mL蒸馏水洗脱，30分钟换一次蒸馏水，直到出现清晰的蛋白质条带为止；第四步：出血毒素的鉴定对每个蛋白质条带，用手术刀切下2.5cm蛋白条带，加0.2mL生理盐水于研钵中磨细，用1mL规格的注射器吸取磨细后的胶体悬浮液，取18-22g小鼠，将胶体悬浮液全部注射到小鼠腹部皮下，1h后断头处死小鼠，解剖后观察是否出现出血点，出血明显的条带既为出血毒素。结果表明，“实施例一”尖吻蝮蛇的酸性蛋白部分总共有12条带，经过检测有4个出血带，既含4种出血毒素；碱性蛋白部分总共有4条带，有1个出血带，既含1种出血毒素；尖吻蝮蛇全毒合计含5种出血毒素。实施例二：第一步：与“实施例一”：第一步相同。第二步：制备电泳分离尖吻蝮蛇毒取尖吻蝮蛇原毒，配制成60mg/mL浓度，其他操作与“实施例一”：第二步相同。第三步：染色与脱色与“实施例一”：第三步相同。第四步：出血毒素的鉴定与“实施例一”：第四步相同。结果表明，“实施例二”与“实施例一”几乎一样，酸性蛋白部分总共有12条带，经过检测有4个出血带，既含4种出血毒素，4个出血带的位置与“实施例一”也一样；碱性蛋白部分总共有4条带，有1个出血带，既含1种出血毒素；尖吻蝮蛇全毒合计含5种出血毒素。实施例三：第一步：与“实施例一”：第一步相同。第二步：制备电泳分离尖吻蝮蛇毒取尖吻蝮蛇原毒，配制成40mg/mL浓度，其他操作与“实施例一”：第二步相同。第三步：染色与脱色与“实施例一”：第三步相同。第四步：出血毒素的鉴定与“实施例一”：第四步相同。结果表明，“实施例三”与“实施例一”和“实施例二”几乎一样，酸性蛋白部分总共有12条带，经过检测有4个出血带，既含4种出血毒素；碱性蛋白部分总共本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，其特征在于，包括以下步骤：a、制备5‑20%梯度聚丙烯酰胺分离胶二块，凝固后的胶从上到下浓度逐渐增大，凝胶的孔径逐渐减小，按常规方法配制浓缩胶，不加梳子；b、将制好的电泳板，每个电泳槽加浓度40‑60mg/mL 尖吻蝮蛇毒1.0 mL，其中一块电泳板正常电泳（酸性蛋白质进入凝胶），另一块电泳板正、负极对调（碱性蛋白质进入凝胶），二块板同时电泳，正常电泳板中溴酚蓝到达凝胶底部后，电泳同时结束，取下凝胶，放塑料盒中待染色；c、用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的“高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒（产品编号：C510041）”染色，染色时间从30分钟缩短为6分钟，用蒸馏水代替试剂盒中的脱色液脱色，直到清晰地出现蛋白质蓝色条带为止；d、对每个蛋白质条带，用手术刀切下2.5 cm蛋白条带，加0.2 mL生理盐水于研钵中磨细，注射到小鼠腹部皮下，1h后解剖观察是否出血，出血明显的条带既为一种出血毒素，总共有多少出血明显的条带表示尖吻蝮蛇毒含多少种出血毒素。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定尖吻蝮蛇毒出血毒素种数的简便方法，其特征在于，包括以下步骤：a、制备5-20%梯度聚丙烯酰胺分离胶二块，凝固后的胶从上到下浓度逐渐增大，凝胶的孔径逐渐减小，按常规方法配制浓缩胶，不加梳子；b、将制好的电泳板，每个电泳槽加浓度40-60mg/mL尖吻蝮蛇毒1.0mL，其中一块电泳板正常电泳（酸性蛋白质进入凝胶），另一块电泳板正、负极对调（碱性蛋白质进入凝胶），二块板同时电泳，正常电泳板中溴酚蓝到达凝胶底部后，电泳同时结束，取下凝胶，放...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦传宝，
申请(专利权)人：安徽威尔试剂盒科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34