本发明专利技术涉及制备一种热休克蛋白专用提取盒。该提取盒可以是由热休克蛋白亲和树脂或亲和层析柱单独组成，或与实施亲和层析所需配制的各种母液等配套组成。其目的是为了方便、快捷、高效、特异性地从组织或细胞中提取热休克蛋白（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）及、或热休克蛋白－多肽复合体（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）。使用热休克蛋白专用提取盒分离纯化出来的热休克蛋白－多肽抗原复合体用于因自身细胞变异、因外源性病原体感染以及自身免疫等疾病的治疗和预防。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
技术介绍
高等生物体之所以能够在复杂的环境中生存是因为机体具有抵御外源入侵的病原体和消除内源变异细胞的能力。一旦这个能力减低或消退，机体就会生病或导致死亡。高等生物体如哺乳动物和人的免疫系统具有体液免疫和细胞免疫的两套机制。一种是以B淋巴细胞为介导的体液免疫，B淋巴细胞在脾脏和骨髓中发育成熟，B淋巴细胞产生的抗体能特异性地识别和结合外源性生物大分子，阻断外源体对机体的侵害。抗原-抗体形成的复合物能够激发机体的补体反应和细胞反应，对携带该外源生物大分子的病原体产生吞噬和降解以排除入侵的病原体。另一种是以在胸腺内发育成熟的T淋巴细胞为介导的细胞免疫。抗原递呈细胞将外源性病原体或内源性变异细胞所携带的异类分子经MHCI类和MHCII类途径将抗原信息递呈给CD8和CD4 T细胞，激发T细胞转变成细胞毒T细胞(CTLs)。经过MHC刺激转化而成的细胞毒杀伤细胞能够特异性地攻击和消除携带抗原的外源性细胞。T淋巴细胞还能分泌产生多种细胞因子，刺激巨噬细胞非特异性地吞噬外源病原细胞。肿瘤细胞虽然能够刺激机体产生抗体反应但很难刺激CTLs激活启动细胞免疫，这是肿瘤细胞能够逃避机体免疫监视的原因之一。如果能够将体液免疫和细胞免疫同时调动起来就会极大地提高机体对消除外源性病原体和自身变异细胞的能力，使机体能够战胜和排除外源病原体或自身变异细胞使疾病消除恢复健康。随着现代生物技术的飞速发展，实验证明细胞内的热休克蛋白(HSP)具有识别和捕捉外源性生物大分子的能力。外源性生物大分子包括外来入侵的病原体，如细菌、支原体、衣原体、病毒所携带的生物大分子等，还包括体内由正常细胞发生突变(如肿瘤细胞等)而产生的变异细胞所携带的生物大分子。热休克蛋白(HSP)是存在于细胞浆内及内质网中的一类家族性看家蛋白，根据HSP的分子大小和结构特性可分为多个家族成员，如HSP-27、HSP-40、HSP-60、HSP-70、HSP-90、HSP-gp96、HSP-110等。它们平时处于低水平的表达。当细胞出现生理性、病理性或环境的突发性变化时，HSP的表达会急剧提高，因此热休克蛋白又被称为“应激蛋白”。HSP通过参与蛋白质的结合、折叠、亚单位的装配、跨膜转运及抗原递呈对细胞的生长、分化、基因转录和自我保护发挥重要作用。HSP目前被应用在预防和治疗传染性疾病和肿瘤治疗就是利用其具有结合外源或自身变异细胞所携带的变异蛋白质或多肽分子群的特性。HSP结合外源病原体或自身细胞变异产生的肿瘤特异蛋白、多肽分子群，参与抗原递呈而其HSP本身并不产生抗原性。T淋巴细胞最终根据HSP递呈的外源分子、多肽来激发机体的免疫系统来攻击和消除携带递呈抗原的外源入侵病原体。因此HSP又被称为“分子伴侣”。研究发现HSP-70、HSP-90、HSP gp96等不仅参与抗原的加工递呈，而且还可作为抗原递呈分子直接将抗原递呈给T细胞，激发T细胞介导的特异性细胞免疫。因此“HSP-多肽抗原复合体”不仅能激发机体对外源病原体产生体液免疫，同时还能产生细胞免疫反应，恢复和提高了机体的免疫监视功能。HSP的这一重要特性奠定了对传染性疾病及肿瘤免疫的个性化治疗和预防的理论和应用的基础。本专利技术是为了方便实验室和医院从人或哺乳动物组织或细胞中提取热休克蛋白及，或热休克蛋白-多肽复合体而设计的一种“热休克蛋白专用提取盒”。
技术实现思路
通过运用生物化学的方法，如亲和层析的方法或ADP-agarose柱层析的方法(参考Peng et al.，Journal of Immunological Methods，204(1997)13-21)可非常简便地、特异性地将HSP蛋白及HSPPC从病理组织、细胞中、从体外被病原体感染的组织及细胞中分离纯化出来。利用可识别人或哺乳动物热休克蛋白的抗体，如HSP-70、HSP-90或HSP gp96抗体制成亲和层析柱，将手术取出的肿瘤组织经切碎、均浆后的细胞裂解液过亲和层析柱，收集洗脱下的专一性吸附的HSP及HSPPC蛋白，经过高效液相色谱(HPLC)的进一步纯化后的HSPPC可注射回该肿瘤病人的体内。以这种方式分离纯化出来的热休克蛋白结合有肿瘤细胞中变异了的蛋白和多肽分子群，将这种取之于肿瘤病人的HSP-肿瘤抗原多肽复合体注射回病人激发肿瘤病人对自身肿瘤的体液免疫和细胞免疫的双重识别和攻击，这种治疗方式开辟了肿瘤个性化免疫治疗的新形式。“热休克蛋白专用提取盒”就是为了满足为肿瘤病人提取自身变异组织内的变异蛋白和多肽激发病人对自身肿瘤的识别和攻击，防止病毒携带者可能引起的交叉感染而提供给肿瘤病人专人专用实现肿瘤个性化治疗的便利工具。将病毒感染的细胞在体外大量培养，将被病毒感染的细胞收集并裂解。细胞裂解液通过使用“热休克蛋白专用提取盒”中提供的HSP亲和层析柱，收集洗脱下的特异性结合病毒多肽分子群的HSPPC。以这种方式分离纯化出来的HSPPC结合有病毒抗原多肽分子群，即为HSP-病毒抗原多肽复合体(HSPPC)。将同源细胞内提取出来的HSPPC给已经感染了该病毒的动物注射能激发其机体抵抗病毒的能力，起到治疗的作用。为尚未感染的同类动物注射起到被动免疫预防被感染的作用。利用“热休克蛋白专用提取盒”提取HSPPC的作用是激发机体对热休克蛋白结合的抗原多肽的免疫识别和攻击，HSPPC作为抗原的优点是1.HSP本身并不参与免疫反应，只有它结合的外源抗原分子才会引起免疫反应，因此不会造成自身免疫，安全性好。2.HSP所结合的是外源目标病原体分子群，它们激发出的抗体是针对由外到内的整个目标病原体，对病原体所携带的抗原包括面广。3.使用HSPPC免疫不用搭配使用佐剂，简便易行。4.HSPPC可以引起机体产生体液免疫和细胞免疫，生物有效性高。5.从取出的病理标本中提取HSPPC再注射回该个体内，实现和达到了有针对性地个性化治疗的目的，专一性好。6.在畜牧业防病治病中，通过体外大量培养目标病原体感染的组织或细胞，从中提取HSPPC用于对目标病原体引起的疾病的治疗和预防，该方法可广泛应用在因各种病原体引起的传染性疾病的治疗和预防，普遍性好。7.HSPPC分子群对机体无毒副作用，应用性强。8.应用“热休克蛋白专用提取盒”使得整个提取过程和操作变得简单、快捷、高效、特异性强。制备的免疫制剂可以从经过偶联了HSP-60抗体、或偶联了HSP-70抗体、或偶联了HSP-90抗体、或偶联了HSP-pg96抗体的亲和层析住上洗脱下来的HSPPC，使用它们的洗脱产物，如HSP70-抗原复合体、或HSP90-抗原复合体、或HSP gp96-抗原复合体作为免疫制剂的成分。“热休克蛋白专用提取盒”中提供的HSP亲和层析柱可以使用一种或一种以上的HSP抗体以不同组合及，或不同比列偶联在树脂上，如将HSP-70抗体、HSP-90抗体和HSP gp96抗体三种抗体以相同的比例偶联在树脂上一同装在一个亲和层析柱内。从该亲和层析柱上洗脱下来的产物含有HSP70-抗原复合体、HSP90-抗原复合体和HSP gp96-抗原复合体，经过透析除去多余的盐分并测蛋白浓度。将含有这三种HSPPC并存的洗脱产物可直接成为免疫制剂中的成分，将它们直接或经过HPLC进一步纯化后可作为免疫制剂成分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ简称ＨＳＰ）及热休克蛋白－多肽复合体（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｐｅｐｔｉｄｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓ简称ＨＳＰＰＣ）专用提取盒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩苏，许佐良，
申请(专利权)人：北京中天康泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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