毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种毕赤酵母表达重组人白介素１１的生产方法，该方法包括反相柱层析、疏水柱层析、凝胶柱层析顺序组合纯化，能够大规模制备得到高纯度的药用重组人白细胞介素１１蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及一种从表达重组人白细胞介素11(rhIL-11)的毕赤酵母工程菌高密度发酵液中大规模纯化rhIL-11的方法。
技术介绍
人白细胞介素11(human Interleukin 11，hIL-11)是与许多造血细胞相互作用的细胞因子，最早是从IL-1a刺激的哺乳动物骨髓细胞系PU-34的条件培养基中被鉴别的活性物质，可长期维持培养的血细胞的生存，随后从人胚胎成纤维细胞系中克隆到hIL-11cDNA。天然的hIL-11成熟蛋白含178个氨基酸，分子量19Kd；不含半胱氨酸，因而缺少二硫键，但蛋白的结构却相当稳定；没有糖基化修饰；富含脯氨酸(12％)，亮氨酸(23％)及正电荷残基(14％)，等电点为11.7。hIL-11是由多种细胞产生并与多种细胞作用的细胞因子。rhIL-11可与其它因子协同作用刺激人的粒细胞，红细胞及巨核细胞的前体细胞生长，最终导致血小板数量的增加。除了造血细胞，rhIL-11还作用于其它细胞，具有促进消化道上皮损伤的恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性(DuXX，Williams DA.Review of molecular，cell biology，and clinic use.Blood，1997，89(11)3897-3908；Reynolds CH.Clinical efficacy of rhIL-11，Oncology(Huntingt)，2000，14(9 Suppl 8)32-40)。1997年，美国Genetic Institute公司(GI)生产的rhIL-11获准上市，用于防止化疗引起的再生性血小板减少症(Kaye JA et al.FDA licensure ofNEUMEGA to prevent severe chemotherapy-induced thrombocytopenia，StemCells，1998，16(Suppl 2)207-223；Rust DM，Wood LS，Battiato LA et al.Oprelvekinan alternative treatment for thrombocytopenia，Clin J OncolNurs，1999，3(2)57-62)。GI于1993年获得hIL-11基因(专利号US5215895)，1997年补充了该专利(专利号US5700664)，1998年获得生产方法专利技术专利(专利号US5760189)。GI采用的是大肠杆菌融合表达生产方法。但这种系统存在以下缺点(1)表达量不高，(2)生产成本过高，(3)蛋白纯化工序复杂。毕赤酵母是近年来发展起来的一种外源蛋白表达系统(Cereghino JL，Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichiapastoris.FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)45-66)。它既具有大肠杆菌系统操作简单的优点，又对重组蛋白有一定的折叠和加工能力。本专利申请人曾提出了用甲醇酵母生产重组人白细胞介素11的方法(申请号99118279.0)，可以极其方便的获得大量具有生物学活性的rhIL-11。但是该方法需要将发酵液离心后通过超滤等方法进行浓缩，去除发酵液中的杂质，降低电导，然后通过离子交换层析，疏水层析及凝胶层析的顺序组合来纯化蛋白，工序比较复杂，经离子交换层析后，杂蛋白和内毒素含量仍然比较高，不利于后续纯化。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种，该方法采用了一般大规模蛋白纯化很少使用的反相层析方法，用来代替常用的超滤浓缩和离子交换层析两个步骤。采用本专利技术的方法，既可以减少纯化工序，也可以提高纯化效率和收率，更有利于杂蛋白和色素，内毒素等杂质的去除。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现一种，毕赤酵母发酵后，发酵液上清依次进行反相柱层析、疏水柱层析和凝胶柱层析纯化得到白介素11。进一步地，反相柱层析过程中，反相层析柱填料为SOURCE 15RPC、SOURCE 30RPC等反相介质；疏水柱层析过程中，疏水柱填料为Phenyl、SOURCE ISO等基团的疏水介质；凝胶柱层析过程中，凝胶柱填料为低吸附的Sephacryl、Superdex或Sephadex等系列介质。本专利技术具有以下技术效果1)采用反相层析的方法可直接纯化发酵液，减少了发酵液的预处理的过程。2)采用反相层析的方法，可使一步纯化所得的rhIL-11的纯度可达到90％以上。3)采用反相层析的方法，可去除大部分的内毒素为后续的纯化工作带来方便。4)反相层析的方法操作简单、方便、省时，有利于大规模的工业生产。5)通过疏水层析的方法，使过反相层析所得的rhIL-11得以精纯化，经反相高效液相层析(HPLC-RP)检测，其纯度大于97％，生物学活性达到0.8×107U/mg以上。6)通过凝胶层析可以改变疏水目标峰的缓冲体系，使所得目标峰可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，减少处理步骤中可能的污染与损失。附图说明图1是反相柱纯化时的rhIL-11梯度洗脱图；图2是经RP-HPLC分析后目标峰A纯度图；图3是疏水柱纯化时的rhIL-11梯度洗脱图；图4是rhIL-11经凝胶柱纯化时的洗脱图。具体实施例方式工程菌毕赤酵母JYIL4(CCTCC NOM204072)进行发酵生产(参考已经公开的专利，申请号99118279.0)，本专利技术采用的是二步法发酵。第一阶段，工程菌接种于甘油或葡萄糖等为碳源的半合成培养基(其配方为六偏磷酸钠25g/L，CaSO4·2H2O 1.176g/L，K2SO418.2g/L，MgSO47.28g/L，EDTA 0.925g/L，甘油40g/L，PTM1 4.35ml/L，(NH4)2SO49g/L，泡敌0.02％。其中PTM1的配方为CuSO4·5H2O 6g/L，NaI 0.08g/L，MnSO4·2H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，硼酸0.02g/L，生物素0.2g/L，CoCl20.5g/L，ZnCl220g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，硫酸5ml)培养16-28小时至甘油或葡萄糖耗尽，菌密度达到大于OD600＝160，此为菌种生长期。第二阶段，甲醇补料到浓度0.5％-5％，诱导表达，表达持续48-96小时达到平台期。其他参数选择；培养温度控制为酵母生长最适的30℃；溶氧15％-35％(搅拌速度相关)；pH3-6，低pH可抑制酵母自身蛋白酶的活性，减少降解。发酵结束后通过离心除去菌体，收集发酵上清后直接通过反相层析、疏水层析及凝胶层析的顺序组合来去除杂蛋白、内毒素、糖类等杂质最终得到纯蛋白。已经报道的纯化方法都是先将发酵上清经超滤浓缩，并用缓冲液来透滤以降低电导达到下一步离子交换层析的要求。而用反相层析来代替一般的离子交换层析可以将发酵上清直接上样，省略超滤步骤，而且，与以往的离子交换层析相比，采用反相层析，不仅可以简化步骤，还可以提高蛋白回收率和纯化效率。从表1可看出，采用本专利技术的反相层析方法，收率、纯度和内毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毕赤酵母表达重组人白介素１１的生产方法，其特征在于，毕赤酵母发酵后，发酵液上清依次进行反相柱层析、疏水柱层析和凝胶柱层析纯化得到白介素１１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄岩山，马国昌，杨志愉，李辉，孙汉栋，徐飞虎，周金宝，
申请(专利权)人：杭州九源基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]