一种R-藻红蛋白的快速分离纯化方法技术

一种Ｒ－藻红蛋白的快速分离纯化方法，属于海洋红藻分离纯化技术领域。本发明专利技术以海洋红藻为材料，应用经冻溶和低离子强度溶涨快速提取Ｒ－藻红蛋白，然后经硫酸铵沉淀进行初步纯化，最后根据Ｒ－藻红蛋白在较宽的ｐＨ范围内保持稳定的特性，利用ＤＥＡＥ　　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　Ｆａｓｔ　　Ｆｌｏｗ离子交换层析技术，用恒定的离子强度、ｐＨ梯度的缓冲液进行洗脱，一步法可以得到高纯度的Ｒ－藻红蛋白。本方法省去了传统的应用分子筛层析结合离子强度洗脱的离子交换层析的复杂分离纯化程序，克服了难于规模化快速制备的难题，操作简便，得率高，容易大量制备并且大大降低了ＲＰＥ的制备成本，从而为将ＲＰＥ应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种R-藻红蛋白的快速分离纯化方法，属于海洋红藻分离纯化

技术介绍
为了研究蛋白质等生物大分子的细胞定位、相互作用及其动态变化，研究人员急需新技术和新材料来实现对蛋白质等生物大分子的“标识”、“阅读”和“查询”。现在常用的荧光标记，由于荧光染料分子荧光特性的限制(荧光光谱较宽、量子产率低)，远远不能适用于高通量的生物大分子专一标识。藻胆蛋白是一类光合作用捕光色素-蛋白质复合物，主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中。在光合作用中起捕获和传递光能的作用，具有强烈的荧光。在蓝藻和红藻中，由2-3种藻胆蛋白组成超分子结构藻胆体，形成高效的能量传递序列。在80年代中期，美国研究藻类光合作用的学者提出将藻胆蛋白作为荧光标记物，用于诊断试剂。由于其独特的优点，藻胆蛋白和藻胆蛋白标记的诊断试剂在90年代初进入国际市场。同常用的荧光标记物相比，藻胆蛋白具有下列优点生产过程安全、无毒，光能吸收强，荧光产率高，超过90％，背景光干扰和假阳性率低，在pH4-11的范围内稳定，可以作双色、三色和四色标记。所以，这类试剂的应用范围不断扩大。但是，由于价格昂贵，尚未应用到普及型的临床诊断试剂。我国全部进口，也仅限于用细胞流式仪进行的诊断。藻胆蛋白及其诊断试剂主要由美国生产，德国也有产品向我国推销，英国和我国台湾正在研制。最早研制产品的是美国分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)，目前西格玛(Sigma)公司共有6种藻胆蛋白产品，藻胆蛋白-Biotin/Avidin标记物12种，RPE-IgG或RPE-IgM12种，RPE单抗标记物3种。藻胆蛋白生产沿用已公开的实验室方法。藻胆蛋白的种类包括异藻蓝蛋白(APC)、藻蓝蛋白(PC)、藻红蓝蛋白(PEC)和藻红蛋白(PE)四大类，其中，藻蓝蛋白和藻红蛋白根据其光谱特性不同又分为CPC、RPC、CPE、b-PE、BPE和RPE(R-藻红蛋白)。其中存在于海洋大型红藻中的RPE是目前最常用的藻胆蛋白荧光探针。因为，RPE色素基团多，亮度大，斯托克位移大。我国沿海大型红藻的资源非常丰富，其中有些是分离纯化R-藻红蛋白(RPE)的很好的材料。国际市场上决定购、销关系的主要是价格因素。影响普及型诊断试剂的开发和应用的主要因素也是藻胆蛋白价格太高。因此，开发RPE的快速高效分离纯化技术，实现高纯度RPE的低成本大量制备，对于RPE在普及型诊断试剂的应用具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种R-藻红蛋白的快速分离纯化方法。本专利技术的R-藻红蛋白的快速高效分离纯化方法，步骤如下(1)原料为海洋红藻，选自多管藻或三叉仙菜。(2)R-藻红蛋白的提取，采用冻溶和低离子强度溶涨的方法，使藻体解体溶解，藻红蛋白释放出来。冷冻保存的红藻藻体10～12g，按体积比1∶1加入0.02/L磷酸缓冲液(pH6.8～7.0)，20～25℃下，融化2～3h，纱布过滤，滤液在4℃下，8000rpm～10000rpm离心10min～15min，上清液即为R-藻红蛋白的粗体液。(3)R-藻红蛋白的初步纯化应用硫酸铵沉淀法，将R-藻红蛋白的粗体液中的R-藻红蛋白从溶液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用20mM磷酸缓冲液(pH6.8～7.0)溶解并透析，除去硫酸铵。(4)一步法制备高纯度R-藻红蛋白根据藻胆蛋白在较宽的pH范围内保持稳定的特性，利用离子交换层析技术，用具有恒定的离子强度、pH梯度的缓冲液进行洗脱，一步法可以得到高纯度的R-藻红蛋白。上述原料多管藻和三叉仙菜为海洋大型红藻，是从沿海潮间带采集，采集后用海水清洗，冷冻保藏。上述步骤(3)R-藻红蛋白的初步纯化具体操作为向上述步骤(2)得到的R-藻红蛋白的粗体液中加入固体硫酸铵，至浓度为55～60％(w/v)，放置4～5h，然后在4℃下，10000rpm～11000rpm离心10min～15min，收集沉淀部分。将沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH6.8～7.0)中，然后对20mM的磷酸缓冲液(pH6.8～7.0)进行透析。收集透析液。上述沉淀与磷酸缓冲液的比例没有严格限定，只要沉淀能够完全溶解即可。上述步骤(4)一步法制备高纯度R-藻红蛋白的具体操作如下取步骤(3)的透析液1～2ml，上DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱，该离子交换色谱柱是经20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.6，含0.05mol/L NaCl)预先平衡的，规格为0.6×10cm，然后用含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.6，)洗脱，最后用20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.6，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0，含0.05mol/L NaCl)各100mL进行梯度洗脱，洗脱速度为60～70mL/h，洗脱曲线见图1，检测波长280，根据洗脱曲线收集蛋白峰5的红色液体，得到纯化的R-藻红蛋白(图2)。经吸收光谱检测，得到的纯化R-藻红蛋白A565/A280达到了5.6。一般认为，A565/A280达到4.5以上，就认为R-藻红蛋白已经纯化，因此，该一步法离子交换层析得到的R-藻红蛋白是高纯化的。同时，A620/A280和A650/A280的比值＜0.001，而C-藻篮蛋白(CPC)和异藻篮蛋白(APC)的最大吸收峰分别位于620nm和650nm，说明分离纯化的RPE没有CPC的和APC的污染。Native-PAGE电泳检测，只有一个条带，进一步表明分离纯化的RPE没有其它蛋白的污染。本专利技术的优良效果在于，以海洋红藻为材料，应用经冻溶和低离子强度溶涨快速提取R-藻红蛋白(RPE)，然后经硫酸铵沉淀进行初步纯化，最后根据R-藻红蛋白(RPE)在较宽的pH范围内保持稳定的特性，利用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析技术，用恒定的离子强度、pH梯度的缓冲液进行洗脱，一步法可以得到高纯度的R-藻红蛋白(RPE)。本方法省去了传统的应用分子筛层析结合离子强度洗脱的离子交换层析的复杂分离纯化程序，克服了难于规模化快速制备的难题，操作简便，省时省力，对设备要求简单，得率高，容易大量制备并且大大降低了RPE的制备成本，从而为将RPE应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础，具有很好的应用前景和经济效益。附图说明图1是实施例1多管藻RPE离子交换层析洗脱曲线(检测波长280)，峰5为R-藻红蛋白。图2是图1的峰5中分离纯化的R-藻红蛋白的吸收光谱(实线)和荧光发射光谱(虚线)。吸收峰分别为498nm、545nm、565nm。用498nm激发，荧光发射峰位于578nm，与标准荧光发射峰相同。图3是实施例1分离纯化的多管藻R-藻红蛋白的Native-PAGE电泳图谱。具体实施方式实施例1R-藻红蛋白的快速高效分离纯化方法，步骤如下(1)原料为多管藻。从沿海潮间带采集，采集后用海水清洗，冷冻保藏。(2)R-藻红蛋白的提取，冷冻保存的多管藻藻体10g，按体积比1∶1加入0.02/L磷酸缓冲液(pH6.98)，24℃下，融化2h，纱布过滤，滤液在4℃下，10000rpm离心12min，上清液即为R-藻红蛋白的粗体液。(3)R-藻红蛋白的初步纯化向上本文档来自技高网...

【技术保护点】
Ｒ－藻红蛋白的快速高效分离纯化方法，步骤如下：（１）原料为海洋红藻，选自多管藻或三叉仙菜；（２）Ｒ－藻红蛋白的提取，冷冻保存的红藻藻体１０～１２ｇ，按体积比１∶１加入０．０２／Ｌ磷酸缓冲液ｐＨ６．８～７．０，２０～２５℃下， 融化２～３ｈ，纱布过滤，滤液在４℃下，８０００ｒｐｍ～１００００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ，上清液即为Ｒ－藻红蛋白的粗体液；（３）Ｒ－藻红蛋白的初步纯化：应用硫酸铵沉淀法，将Ｒ－藻红蛋白的粗体液中的Ｒ－藻红蛋白从溶液中沉淀出来 ，向上述步骤（２）得到的Ｒ－藻红蛋白的粗体液中加入固体硫酸铵，离心收集沉淀，再用２０ｍＭ磷酸缓冲液ｐＨ６．８～７．０溶解并透析，除去硫酸铵；（４）一步法制备高纯度Ｒ－藻红蛋白：利用离子交换层析技术，用具有恒定的离子强度、ｐＨ梯度的缓 冲液进行洗脱，得到高纯度的Ｒ－藻红蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉忠，刘鲁宁，陈秀兰，周百成，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]