一种法氏囊素三肽合成方法技术

一种法氏囊素三肽合成方法，合成方法按如下步骤进行：氨基酸保护→保护组氨酸－甘氨酸甲酯二肽合成→保护组氨酸－甘氨酸二肽的脱氨基保护→保护赖氨酸－组氨酸－甘氨酸的合成→保护赖氨酸－组氨酸－甘氨酸的脱氨基保护→法氏囊素三肽粗品的合成→法氏囊素三肽粗品的纯化，本发明专利技术的合成方法，可以大量合成制取高纯度的法氏囊素三肽，因而使ＢＳ的产量得到了提高，生产成本降低，同时具有重大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制剂的合成方法，尤其是涉及。
技术介绍
病毒性传染病的发生是影响畜牧业发展的一个重要因素，大多数病原微生物侵入机体后，能造成免疫器官包括法氏囊素的损伤，使机体免疫功能低下，抗病力减弱，使疫病进一步发展，同时，引发继发感染及免疫失败，给养殖业造成巨大损失，实践证明，单纯依靠疫苗免疫一方面由于多种原因引起的免疫失败，另一方面由于疫苗本身保护率的限制，很难完全防止传染病的发生，因而，探求免疫增强剂，保护、提高机体免疫力和研制积极有效的病毒性疾病防治方法，已成为世界各国兽医工作者努力的热点。目前研究较多的免疫增强剂主要有微生物、化学剂、生物剂、生物制剂和中药制剂，生物制剂的免疫增强效果好，但由于成本高而极大地限制了其在兽医临床中的应用。因此，降低成本或探求成本低廉、效果好的免疫增强剂已成为兽医工作者的一项重要任务。法氏囊素是法氏囊组织提取物中唯一一种化学组成已被确定的生物活性分子，由T.Audhya等于1986年从鸡法氏囊组织抽提液中纯化并定名，其化学组成为三肽，即Lys-His-Gly-NH2。研究证明BS在体外具有诱导B淋巴细胞系分化的功能，并对B淋巴细胞抑制有拮抗作用，能提高人B细胞系-Duadi细胞内cGMP水平，发育生物学研究表明，BS能保护和促进法氏囊的正常发育，对鸡的促肾上腺皮质激素中枢和生物节律调节中枢的形成和发育起关键作用。对法氏囊素的研究表明显示BS在提高机体免疫力及作为免疫增强剂，在提高疫苗效果和疫病防治等方面具有重要的应用价值，而BS在哺乳动物及人类某些方面的免疫功能更显示了广泛的应用前景。但是由于法氏囊素其在组织内含量甚微，加之法氏囊素组织本身体积较小，因而很难获得大量纯品，限制了其研究与应用，在此情况下，建立人工合成方法，使BS的产量提到提高具有十分诱人的前景，同时具有重大的应用价值。
技术实现思路
针对传统方法对法氏囊素制取较难，制取量小的问题，本专利技术的目的是提供一种生产量大、生产成本低的法氏囊素三肽合成方法。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案为，其特征在于合成方法按如下步骤进行氨基酸保护→保护组氨酸-甘氨酸甲酯二肽合成→保护组氨酸-甘氨酸二肽的脱氨基保护→保护赖氨酸-组氨酸-甘氨酸的合成→保护赖氨酸-组氨酸-甘氨酸的脱氨基保护→法氏囊素三肽粗品的合成→法氏囊素三肽粗品的纯化，其中(1)氨基酸保护a、将赖氨酸、组氨酸溶于NaOH中，置冰盐浴中冷却，搅拌下滴入预先用THF溶解的Z-Cl或Fmoc-Cl或(Boc)2O，同时滴入NaOH使溶液保持pH＝8～10。加完后自然升温至室温，继续搅拌0.5～2小时，然后，用乙醚洗2～3次，分去醚层，水相在搅拌下滴入盐酸使pH＝0.5～1.5，再加入乙酸乙酯，继续搅拌5～10分钟后分液，乙酸乙酯层用稀NaCl洗至中性、无水Na2SO4干燥、减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂，最后得到氨基保护赖氨酸Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys和氨基保护组氨酸Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His；b、将甘氨酸溶于甲醇中，置冰盐浴中冷却至-5～-10℃，缓慢滴入氯化亚砜，再加入浓硫酸，15～25℃放置1.5～4小时，再在70～80℃水浴回流30～50分钟，然后，减压蒸馏除去甲醇后加入乙醚，0～4℃放置1～2小时，待结晶完全后，过滤，再用无水乙醇洗涤结晶，最后得到GlyOCH3；(2)、保护组氨酸-甘氨酸二肽的合成取Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His溶解于水四氢呋喃中，用冰盐浴冷至-5～0℃，在搅拌过程中分别滴入预先用四氢呋喃溶解的HOSu和DCC或HOBt和DCC。滴完后在-5～0℃反应20～60分钟，然后在-5～0℃加入预先用DMF溶解的GlyOCH3及NMM，再在-5～0℃反应20～60分钟，然后室温反应2～6小时，反应结束后，过滤，将滤液旋蒸至干，加入水和乙酸乙酯，然后转移至分液漏斗分液，水相用适量的乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯有机层，分别用蒸馏水，饱和柠檬酸，饱和NaHCO3液和饱和NaCl液洗涤，并用无水Na2SO4干燥8～16小时、过滤、旋蒸出乙酸乙酯，最后得到为淡黄色粘稠液体的保护基2-His-GlyOCH3·HCl；(3)、脱氨基保护的组氨酸-甘氨酸二肽的合成；将上述淡黄色粘稠液体的保护基2-His-Gly OCH3·HCl加入饱和的无水HCl-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，直至不再析出大量白色沉淀为止，反应完毕后，在旋转蒸发仪上蒸干溶剂，最后得到His-Gly OCH3·HCl；(4)、保护赖氨酸-组氨酸-甘氨酸的合成将His-Gly OCH3·HCl溶于适量的DMF中，并加入N-甲基吗啉(NMM)，然后在-5～0℃搅拌20～60分钟，得到待用化合物；将氨基保护赖氨酸Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys，用适量THF溶解，冰盐浴冷却至0～5℃，在该温度下滴加用THF溶解的DCC，HOSu或DCC，HOBt。滴毕后，在该温度下继续搅拌反应2～4小时，然后在0～5℃滴入待用化合物和N-甲基吗啉DMF溶液，滴毕，在0～5℃继续搅拌反应20～60分钟，然后升温至室温，继续搅拌反应24～48小时，待反应完毕后，将反应液过滤，滤液旋蒸至干，再加入乙酸乙酯，然后转移至分液漏斗，加入蒸馏水，分液，水层用乙酸乙酯萃取2～3次，合并有机层，分别用饱和柠檬酸、饱和NaHCO3液和饱和NaCl液洗涤，洗至pH＝6～7，有机层用无水Na2SO4干燥8～16小时、过滤、减压旋蒸出溶剂，最后得到保护基2-Lys-His-GlyOCH3·HCl；(5)、脱氨基保护的赖氨酸-组氨酸-甘氨酸三肽的合成将保护基2-Lys-His-GlyOCH3·HCl加入饱和的无水HCl-乙酸乙酯溶液，室温搅拌2～6小时，反应完毕后，在旋转蒸发仪上蒸干溶剂，得到Lys-His-GlyOCH3·HCl；(6)、法氏囊素三肽粗品的合成将Lys-His-Gly OCH3·HCl用无水乙醇溶解，用冰盐浴冷却至0～5℃，通入干燥的NH3至溶液饱和，室温放置3天以上，然后将溶液在旋转蒸发仪上蒸干溶剂，最后得到粗品；(7)、纯化将上述粗品用无水乙醇溶解，再过滤，将滤液在旋转蒸发仪上蒸干溶剂，最后得纯度达95％以上的法氏囊素三肽纯品Lys-His-Gly-NH2·HCl。在所述的保护组氨酸-甘氨酸二肽的合成方法中，在Boc2-His或Fmoc2-His或Z2-His加入预先用DMF溶解的GlyOCH3及NMM后，在反应过程中用TLC监测反应进程，该TLC的薄层板为市售硅胶G板，展开剂为石油醚∶丙酮＝4∶1，2％茚三酮乙醇溶液显色。在所述的保护赖氨酸-组氨酸-甘氨酸的合成方法中，在Boc2-Lys或Fmoc2-Lys或Z2-Lys滴入待用的化合物和N-甲基吗啉DMF溶液后，在反应过程中用TLC监测反应进程。本方案改变了以前从鸡法氏囊组织抽提法氏囊素的状况，因为法氏囊素其在组织内含量甚微，加之法氏囊素组织本身体积较小，很难获得大量纯品，限制了其研究与应用，而通过本专利技术的合成方法，可以大量合成制取高纯度的法氏囊素三肽，因而使BS的产量得到了提高，生产成本降低，具有十分诱人的前景，而且具有重大的应用价值。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术进行进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种法氏囊素三肽合成方法，其特征在于：合成方法按如下步骤进行：氨基酸保护→保护组氨酸－甘氨酸甲酯二肽合成→保护组氨酸－甘氨酸二肽的脱氨基保护→保护赖氨酸－组氨酸－甘氨酸的合成→保护赖氨酸－组氨酸－甘氨酸的脱氨基保护→法氏囊素三肽粗品的合成→法氏囊素三肽粗品的纯化，其中（１）氨基酸保护ａ、将赖氨酸、组氨酸溶于ＮａＯＨ中，置冰盐浴中冷却，搅拌下滴入预先用ＴＨＦ溶解的Ｚ－Ｃｌ或Ｆｍｏｃ－Ｃｌ或（Ｂｏｃ）↓［２］Ｏ，同时滴入ＮａＯＨ使溶液保持ｐＨ＝８～１０。加完后自然 升温至室温，继续搅拌０．５～２小时，然后，用乙醚洗２～３次，分去醚层，水相在搅拌下滴入盐酸使ｐＨ＝０．５～１．５，再加入乙酸乙酯，继续搅拌５～１０分钟后分液，乙酸乙酯层用稀ＮａＣｌ洗至中性、无水Ｎａ↓［２］ＳＯ↓［４］干燥、减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂，最后得到氨基保护赖氨酸Ｂｏｃ↓［２］－Ｌｙｓ或Ｆｍｏｃ↓［２］－Ｌｙｓ或Ｚ↓［２］－Ｌｙｓ和氨基保护组氨酸Ｂｏｃ↓［２］－Ｈｉｓ或Ｆｍｏｃ↓［２］－Ｈｉｓ或Ｚ↓［２］－Ｈｉｓ；ｂ、将甘氨酸溶于甲醇中，置冰盐浴中冷却至－５～ －１０℃，缓慢滴入氯化亚砜，再加入浓硫酸，１５～２５℃温度下放置１．５～４小时，再在７０～８０℃水浴回流３０～５０分钟，然后，减压蒸馏除去甲醇后加入乙醚，０～４℃温度下放置１～２小时，待结晶完全后，过滤，再用无水乙醇洗涤结晶，最后得到ＧｌｙＯＣＨ↓［３］；（２）、保护组氨酸－甘氨酸二肽的合成取Ｂｏｃ↓［２］－Ｈｉｓ或Ｆｍｏｃ↓［２］－Ｈｉｓ或Ｚ↓［２］－Ｈｉｓ溶解于水四氢呋喃中，用冰盐浴冷至－５～０℃，在搅拌过程中分别滴入预先用四氢呋喃溶解的ＨＯＳｕ和ＤＣＣ或 ＨＯＢｔ和ＤＣＣ，滴完后在－５～０℃温度下反应２０～６０分钟，然后在－５～０℃温度下加入预先用ＤＭＦ溶解的ＧｌｙＯＣＨ↓［３］及ＮＭＭ，再在－５～０℃温度下反应２０～６０分钟，然后室温反应２～６小时，反应结束后，过滤，将滤液旋蒸至干，加入水和乙酸乙酯，然后转移至分液漏斗分液，水相用适量的乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯有机层，分别用蒸馏水，饱和柠檬酸，饱和ＮａＨＣＯ↓［３］液和饱和ＮａＣｌ液洗涤，并用无水Ｎａ↓［２］ＳＯ↓［４］干燥８～１６小时、过滤、旋蒸出乙酸乙酯，最后得到为淡黄色粘稠液体的保护基↓［２］－Ｈｉｓ－ＧｌｙＯＣＨ↓［３］.ＨＣｌ；（３）、脱氨基保护的组氨酸－甘氨酸二肽的合成；将上述淡黄色粘稠...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹冶，李键，靳亚平，李清寒，张红，赵素君，李红，周洪群，
申请(专利权)人：四川键宇胚胎工程有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]