蛋白质制备制造技术

蛋白质可以由经基因工程改造过的微生物制备，这些蛋白质以包涵体（ＩＢ）形式被贮存。包涵体中的蛋白质处于不溶解无活性的形式。它们可以用增溶剂（１８）溶解，将得到的溶液稀释使蛋白质重新折叠成有活性的形式。该蛋白质重新折叠的过程可以通过将蛋白质溶液或混悬液经过低强度声波（２５）处理而得到加强，并且该强度应足够低使蛋白质不至于变性。该强度可以为１０－１００ｍＷ／ｃｍ↑［２］。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请涉及一种制备蛋白质溶液的方法及装置，其中该溶液中蛋白质处于合适的折叠状态，具有适当的或有活性的二级或三极结构。一类复杂有机分子可以在包括细菌、植物、真菌和哺乳动物细胞的细胞内被合成。例如该合成过程可以在细菌细胞中通过发酵过程被实现。之后，希望得到的产物分子必须从细胞中被回收和纯化。特别地，在经基因工程改造的微生物的蛋白质生产中，细胞可能会过量表达蛋白，产生不能溶解的蛋白质聚集物，称作包涵体。在已知方法中，这些包涵体可以通过细胞溶解以及随后的例如离心或者，微量过滤与其它细胞成分分离。包涵体中的蛋白质不溶解并且没有活性，据推测，是因为分子被缠结和/或被错误的折叠。一个已知的处理方法包含用增溶剂处理包涵体(这样分子就不再被缠结)，然后除去或稀释增溶剂使蛋白质重新折叠成具有活性的形式。这个稀释步骤容易倾向于无效，所以有些蛋白质重新聚集成不溶解和无活性的形式，而需要的稀释度通常很高，导致产生大量的但极稀的蛋白质溶液。在工业规模上，由包涵体中的蛋白质转化成有活性的产物的比例典型地只有大约10％，而20％的转化即被认为很好。根据本专利技术，提供一种引起蛋白质重新折叠的方法，其中将蛋白质的溶液或混悬液经低强度声波处理，处理时，声波的强度应足够低，使蛋白质不至于变性。声波可以是任何合适的频率，可以大于约10到20kHz，即波是超声波。典型地，频率应小于1MHz，并且通常小于200kHz。强度必须小于发生声穴的强度。例如小于约0.3W/cm2的强度，合适的强度可以是例如0.05或0.1W/cm2，但强度的上限取决于容器的几何形状，声波的频率和液体的粘度。它还取决于液体中是否含有溶解的气体。它随着频率的增加而增加，但是不是呈线性变化；例如对于室温下的汽水，阈值由10kHz下约0.24W/cm2和20kHz下0.3W/cm2增加到100kHz下大约1.0W/cm2。这里给出的功率值是由电功率传递到换能器上的数值，因为这样相对容易测量。蛋白质的溶液或混悬液可以由任何合适的方法制备。一种方法包括通过将已溶解蛋白质的溶液与稀释液混合而稀释该溶液。该混合过程优选通过流体涡旋混合器来进行，因为这样可以达到快速并且完全的混合。用声波辐射可以在该混合步骤之后立刻进行。流体涡旋合器包含一个大体上是圆柱形的腔，在腔的底壁中心有一个轴向的出口管，并且在腔的外周至少有一个大体上呈切线方向的入口，以在腔中制造出螺旋水流。第二种液体通过第二个切线方向的入口提供，或者通过一个径向的入口提供。腔不包括产生湍流的叶片或挡板。这样的混合器使两种液体在很短时间内充分混合，而不使液体经受很高的剪切力。与其他类型的混合器相比，它更不容易被例如蛋白质沉积物弄脏。混合物通过混合器的时间即停留时间可以少于1s。可以用上述方法重新折叠的蛋白质的例子包括那些预期用于治疗目的的蛋白质，和那些从经基因工程改造过的细胞系得到的蛋白质，例如干扰素，蛋白质疫苗，酶和激素。并且“蛋白质”这个术语还应被解释为包括糖蛋白和脂蛋白在内。将本专利技术的方法运用于蛋白质的不同混合物也是可行的。本专利技术还包含一种用于重新折叠蛋白质的装置。现将仅通过举例和参考表示蛋白质回收系统的流程图的附图来更进一步和更具体地描述本专利技术。关于附图，步骤10表示获得活性蛋白质的步骤。为获得想要的蛋白质，将基因工程改造过的细菌(大肠埃希杆菌)在发酵容器中生长(12)。该细菌过量表达蛋白质，这些蛋白储存于细菌中的包涵体，并处于不溶解、缠结、无活性的状态。当充分发酵时，细胞的水性混悬液经过细胞溶解(14)，然后离心(16)从废弃物流中分离出包涵体IB。之后，包涵体IB经过用合适的试剂例如尿素或盐酸胍的溶解作用而被溶解(18)，这样导致蛋白质解开缠结。得到的无活性蛋白质的溶液加入流体涡旋混合器(20)中的一个切线方向的入口(21)，重折叠缓冲液作为稀释剂加入流体性涡旋混合器(20)的第二个切线方向的入口(22)，这样稀释后的溶液在混合器(20)中经过一段停留时间后从轴向的出口(24)流出，上述停留时间典型为少于0.1s。该重折叠缓冲液可以是一种含水溶液，包含较低浓度的增溶剂，和能够促进蛋白质重新折叠步骤的化合物例如谷胱甘肽。重折叠缓冲液的流速可以比无活性蛋白质溶液的流速高200倍。举例来说，混合器(20)中的圆柱形腔的直径可以是10mm，高2mm，每个入口管(21和22)的横截面积为1mm2，出口管(24)的横截面积为2mm2；当流速为1升/分钟时，停留时间为约8ms。如果通过混合器(20)的流速减半为0.5L/min，则平均停留时间会加倍为大约16ms。流出物经混合器(20)的出口管(24)流入一个贮藏罐(28)，使蛋白质有足够的时间重新折叠成有活性的形式。一个或多个超声波换能器(25)偶联于贮藏罐(28)的壁，并与一个信号发生器(26)连接。换能器(25)典型地以从10kHz到250kHz范围内的频率工作，例如130kHz。这样每个换能器(25)计划在液相(在该频率下低于空化阈)中产生最大为0.6W/cm2的强度，使内容物经低强度超声处理。贮藏罐(28)可以是活塞流反应器，或者有挡板的搅动反应容器；活塞流反应器可以是脉冲式的，例如在WO00/29545中描述的那样，并且可以分批或连续操作。贮藏罐(28)中的停留时间希望为1-10小时，优选2-6小时。也可设置超声波换能器使出口管(24)的内容物经受所述低强度超声波。无论如何，不管溶液在流经出口管(24)时还是停留于贮藏罐(28)时经声波处理，很重要的是强度不能太高而发生空化事件(可以导致蛋白质变性)。因此强度应该低于300mW/cm2，并且通常应低于100mW/cm2；但是强度也应足够强以储存足够的能量，所以应当大于10mW/cm2。此外，换能器可以在固定的频率例如20或40kHz提供能量，或者可变的频率下提供能量，例如在19.5到20.5kHz之间变化。上述溶液还可以经过更进一步的处理，例如液相色谱法和过滤，以从溶液中的活性蛋白质中分离出任何聚集(可导致无活性)的蛋白质。权利要求1.一种使蛋白质重新折叠的方法，其中蛋白质的溶液或混悬液经过低强度声波处理，并且该强度足够低使蛋白质不至于变性。2.如权利要求1所述的方法，其中声波的强度为10-300mW/cm2。3.如权利要求1或2所述的方法，其中强度小于100mW/cm2。4.如上述任一项权利要求所述的方法，其中声波的频率大于10kHz。5.如上述任一项权利要求所述的方法，其中蛋白质的溶液或混悬液是通过稀释已溶解的蛋白质溶液而制备的，所述稀释是通过将所述溶液与稀释液混合而进行的。6.如权利要求5所述的方法，其中混合步骤是通过一个流体涡旋混合器而进行。全文摘要蛋白质可以由经基因工程改造过的微生物制备，这些蛋白质以包涵体(IB)形式被贮存。包涵体中的蛋白质处于不溶解无活性的形式。它们可以用增溶剂(18)溶解，将得到的溶液稀释使蛋白质重新折叠成有活性的形式。该蛋白质重新折叠的过程可以通过将蛋白质溶液或混悬液经过低强度声波(25)处理而得到加强，并且该强度应足够低使蛋白质不至于变性。该强度可以为10－100mW/cm文档编号B01F5/00GK1697660SQ03822144 公开日2005年11月16日 申请日期2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使蛋白质重新折叠的方法，其中蛋白质的溶液或混悬液经过低强度声波处理，并且该强度足够低使蛋白质不至于变性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：LJ麦考斯兰德，
申请(专利权)人：阿山特斯有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]