本发明专利技术涉及Ｓａ抗原的纯化方法，是在Ｄｅｓｐｒｅｓ布氏漏斗法提取Ｓａ粗抗原的基础上，采用ＣＮＢｒ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ与抗Ｓａ ＩｇＧ偶联制成亲和层析柱，对Ｓａ粗抗原进一步纯化，得到纯度更高的Ｓａ抗原。经１０％ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，显示本发明专利技术纯化的Ｓａ抗原电泳条带明显减少，免疫印迹法检测也发现抗Ｓａ抗体的显色条带清晰易辨。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用抗Sa抗体诊断类风湿关节炎中使用的Sa抗原底片，特别是涉及。
技术介绍
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种表现为多关节慢性炎症为主的自身免疫性疾病，主要表现为慢性、对称性、侵蚀性关节炎，大多病情呈进行性，最终导致关节纤维性僵直、纤维性或骨性强直而严重致残。RA的诊断，尤其是早期诊断是世界性的难题。RA患者经早期诊断、早期积极治疗，可以改变病情以降低致残率。现行的美国风湿病学会(ACR)1987年RA分类诊断标准，主要是依靠临床表现、X线改变和类风湿因子(RF)的检测进行综合判断，缺乏可靠的客观指标，往往是符合上述判断标准时，病人已经出现了骨质的破坏，使得早期病例难以诊断。RF是分类诊断标准内唯一的血清学指标，但RF可出现于许多结缔组织病及其它疾病中，如急性病毒感染和结核患者，甚至5％的正常人群中也可能出现，对于诊断RA的特异性很差，不利于早期诊断、早期干预治疗。因此，国内外学者在探讨RA特异性诊断指标方面进行了大量研究工作，相继发现了一些RA患者血清中存在的，对RA较为特异的自身抗体，如抗核周因子抗体(APF)，抗角蛋白抗体(AKA)，抗Sa抗体，抗RA33抗体，抗胶原蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体(AFA)，抗环瓜氨酸肽抗体等。这些自身抗体不同程度地具有一定的早期诊断价值。1994年，Despres等发现了抗Sa抗体，认为对RA的特异性高达98.9％，且在早期RA患者中阳性率为23.5％。为此，国内外学者在抗Sa抗体方面进行了大量的研究工作，但该项成果却迟迟未能应用于临床，其主要原因之一是Sa抗原极易分解，Sa抗原的提取过程必须保持在4℃进行，且需加入多种蛋白酶抑制剂抑制Sa抗原的降解，提取过程操作困难；其二是Sa抗原需从人胎盘或脾脏中提取，这些组织中蛋白成分丰富，Sa抗原不宜分离、纯化，很难得到纯的Sa抗原，在临床上应用难以避免批间差异。用Despres布氏漏斗法制备Sa抗原的方法是取新鲜人胎盘组织，匀浆，4℃10000rpm/min离心60分钟；取上清液与预冷活化的DE52混合搅拌60分钟，布氏漏斗抽滤并用匀浆缓冲液洗涤、抽干；将DE52与洗脱液1混合搅拌60分钟，布氏漏斗抽滤，洗脱液1洗涤、抽干，弃滤液；DE52再与洗脱液2混合搅拌60分钟，布氏漏斗抽滤，洗脱液2洗涤，收集滤液；滤液装入透析袋中，用预冷的含0.15mmol/L PEMSF蒸馏水透析24～36小时，冷冻干燥(Despres N，BoireG，lopez-longo FJ，et al.The Sa systema novel antigen-antibody system specificfor rheumatoid arthritis.J Rheumatol，1994，211027-1033)。将上述布氏漏斗法提取的Sa抗原用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以看到大约8～9种不同分子量的蛋白条带，且浓度基本相同。将电泳凝胶转印至硝酸纤维素膜再通过免疫印迹法检测抗Sa抗体时，由于蛋白条带较多，首先可能将与Sa抗原分子量接近的条带误认为阳性，其次可能由于非特异性抗体的显色而影响所测条带。
技术实现思路
本专利技术的目的是在提取Sa抗原的基础上，提供一种进一步纯化Sa抗原的方法，得到纯度更高的Sa抗原，通过免疫印迹法检测显示非特异性条带明显减少，抗Sa抗体的条带更为清晰易辨。本专利技术是在原Sa粗抗原提取的基础上，采用亲和层析法对Sa粗抗原进一步纯化，以得到纯化的Sa抗原。纯化Sa抗原的具体步骤包括a)纯化抗Sa抗体在缓冲液B中将Protein G Sepharose 4 Fast Flow浸泡脱气，装柱，缓冲液B平衡；取RA患者血清，离心、0.22μm滤膜过滤、缓冲液B透析，得到抗Sa阳性血清；将抗Sa阳性血清上柱孵育30分钟，先用缓冲液B洗柱，去除杂蛋白，再用洗脱液A洗脱，洗脱液收集到预置中和缓冲液的收集管中，透析后得到抗Sa IgG。b)制备亲和层析柱取活化的CNBr-Sepharose 4B，在偶联缓冲液中与纯化的抗Sa IgG混合，4℃摇荡过夜，用偶联缓冲液淋洗，洗脱未结合蛋白后，将制备好的亲和介质移入阻断缓冲液中，室温孵育2小时，封闭剩余的反应位点；之后将亲和介质用偶联缓冲液和醋酸盐缓冲液交替淋洗，在缓冲液C中浸泡脱气，装柱，缓冲液C平衡，制成亲和层析柱。c)Sa抗原的亲和层析取Sa粗抗原，在亲和层析柱上循环上样5小时，用缓冲液C洗柱，洗脱杂蛋白，洗脱液B洗脱，洗脱液收集到预置中和缓冲液的收集管中，透析后得到纯化的Sa抗原。其中，在步骤a)中使用的缓冲液B为pH7.0，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液；洗脱液A为除气过滤后的pH2.7的0.1mol/L甘氨酸-盐酸溶液；中和缓冲液为1mol/L Tris，pH9.0。步骤b)中使用的缓冲液C为pH7.4，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液；偶联缓冲液为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHCO3，pH8.3；阻断缓冲液为1％牛血清白蛋白，pH8.0；醋酸盐缓冲液为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaAc，pH4.0。步骤c)中使用的洗脱液B为除气过滤后的pH2.5的0.1mol/L甘氨酸-盐酸溶液。本专利技术从人胎盘组织中提取粗Sa抗原，利用抗原与抗体特异性、可逆性结合的特点，采用亲和层析法对Sa抗原进行纯化，以达到分离纯化Sa抗原的目的，抗原纯化程度高，经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果显示纯化的Sa抗原电泳条带明显减少；免疫印迹法检测也发现抗Sa抗体的显色条带清晰易辨。使用本专利技术纯化后的Sa抗原对206例RA患者的血清进行检测，并以粗Sa抗原进行对照，结果见表1。从表1可以看出，粗Sa抗原所测得的72例阳性血清中，纯化Sa抗原检测也全部为阳性，而纯化Sa抗原又在粗Sa抗原所测144例阴性血清中测出5例阳性，说明纯化Sa抗原可以提高抗Sa抗体的检测阳性率。表1 粗抗原与纯化抗原检测抗Sa抗体的比较亲和层析法纯化Sa抗原 粗Sa抗原阳性7772阴性129 134合计206 206阳性率％37.38 34.95X2值0.084P值 0.786实验也证实，纯化Sa抗原的实验重复性较好，Sa抗原冻干粉可以长期保存，转印至膜上的抗原在4℃保存1年后活性不变，新旧抗原检测抗Sa抗体的符合率为100％。附图说明图1为粗Sa抗原与纯化Sa抗原的10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；图2为粗Sa抗原与纯化Sa抗原的免疫印迹法抗体检测结果。具体实施例方式1.使用Protein G Sepharose 4 Fast Flow纯化抗Sa抗体取5mLRA患者血清，经免疫印迹法检测抗Sa抗体阳性，且抗体滴度较高，＞1∶64，免疫双扩法及免疫印迹法检测ENA多肽阴性后，离心，0.22μm滤膜过滤，将滤液在含有0.9％NaCl的0.02mol/L PB缓冲液(pH7.0)中透析过夜，得到抗Sa阳性血清。将5mL Protein G Sepharose 4 Fast Flow在玻璃烧结漏斗上用蒸馏水反复淋洗，抽干，置于上述的缓冲液中浸泡脱气后，装入层析柱，再用缓冲液平本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｓａ抗原的纯化方法，是采用亲和层析法对提取的Ｓａ粗抗原进一步纯化，以得到纯化的Ｓａ抗原，其特征是包括以下步骤： ａ）纯化抗Ｓａ抗体 在缓冲液Ｂ中将Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ浸泡脱气，装柱，缓冲液Ｂ平衡；取ＲＡ患者血清，离心、０．２２μｍ滤膜过滤、缓冲液Ｂ透析，得到抗Ｓａ阳性血清；将抗Ｓａ阳性血清上柱孵育３０分钟，先用缓冲液Ｂ洗柱，再用洗脱液Ａ洗脱，洗脱液收集到预置中和缓冲液的收集管中，透析后得到抗Ｓａ ＩｇＧ； ｂ）制备亲和层析柱 取活化的ＣＮＢｒ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ，在偶联缓冲液中与纯化的抗Ｓａ ＩｇＧ混合，４℃摇荡过夜，偶联缓冲液淋洗后移入阻断缓冲液中，室温孵育２小时，制成亲和介质；制成的亲和介质用偶联缓冲液和醋酸盐缓冲液交替淋洗后，在缓冲液Ｃ中浸泡脱气，装柱，缓冲液Ｃ平衡，制成亲和层析柱； ｃ）Ｓａ抗原的亲和层析 取Ｓａ粗抗原，在亲和层析柱上循环上样５小时，缓冲液Ｃ洗柱，洗脱液Ｂ洗脱，洗脱液收集到预置中和缓冲液的收集管中，透析后得到纯化的Ｓａ抗原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李小峰，魏华，胡学芳，高圆，陈竹，国华，
申请(专利权)人：李小峰，
类型：发明
国别省市：14[中国|山西]
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