用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒及建库方法技术

本发明专利技术涉及用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒及建库方法。本发明专利技术的孕妇外周血中游离DNA检测的文库构建方法及试剂盒可用于孕妇外周血中游离DNA检测，例如产前诊断。所述构建测序用DNA文库的方法包括将平末端DNA片段中的至少一部分进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段的步骤；和将步骤B‑1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接的步骤。

【技术实现步骤摘要】
用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒及建库方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒及建库方法。
技术介绍
血中游离DNA即循环脱氧核糖核酸(circulatingDNA)，是循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。1948年Mandel和Metais首次发现血中存在细胞外核苷酸。早期由于检查技术的限制，相关临床应用在近年才得到了长足的发展。1994年，在肿瘤病人的血液中检测到RAS基因的突变，1997年香港中文大学卢煜明(DennisLo)教授等发现孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA。目前认为血中游离DNA的来源与凋亡、坏死和细胞主动分泌DNA有关。正常生理情况下，巨噬细胞会清除凋亡和坏死细胞，因此健康人血中游离DNA浓度很低。在恶性肿瘤、剧烈运动或体内存在验证等情况下，巨噬细胞不能有效清除凋亡和坏死的细胞，细胞内的DNA被释放至血中。多种病理状态下血中游离DNA的水平和组成会发生改变。肿瘤患者外周血中游离DNA水平高于正常人且可具有肿瘤细胞DNA的特征。血中游离DNA定性定量分析已开始应用于肿瘤的早期诊断、个体化治疗和预后判断等。此外，孕妇血中存在胎儿DNA，检测母体血浆中胎儿游离DNA获取胎儿遗传信息，用于产前诊断，与有创产前相比，具有无创、无痛、安全等优势。2014年国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准了基于二代测序的无创产前检测临床应用的试剂盒，无创产前诊断技术已经日趋成熟，但是，高通量基因检测在推广方面还面临经济性难题。暂时只在产前血清学筛查高危、中等风险的孕妇中有较高的应用率。因此，不仅需要在测序检查的质量控制、检测效率方面做技术改进，成本优化，降低消费者负担，也是本领域亟待解决的技术问题。一般而言，二代DNA测序使用包含用于测序的双链DNA的测序用DNA文库来进行。所述用于测序的双链DNA中，单个的待测序DNA片段被插入在5'序列与3'序列之间，所述5'序列与3'序列分别包含与测序引物匹配的碱基序列。由于二代DNA测序技术的限制，所述单个的待测序DNA片段的长度通常为约10bp～500bp。在使用上述测序用DNA文库进行的二代DNA测序中，需要对每个包含单个的待测序DNA片段的用于测序的双链DNA分别读取数据，即，一个测序流程中只能获得一个待测序DNA片段的数据，尽管现有的测序仪已经可以从双链DNA的两端同时读取数据。使用这种传统的测序用DNA文库进行测序，测序试剂用量大、测序用时长，因而测序成本高、测序效率低。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序DNA文库的方法以及用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒，其中，使用采用该方法构建的二代测序DNA文库进行测序能够减少测序试剂用量、缩短测序用时，因而能够降低测序成本、提高测序效率。本专利技术的专利技术人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过在传统的构建二代测序用DNA文库的方法中，将双3'端加A的步骤变更为单3'端加A的步骤并增加平末端连接步骤，就能够在用于测序的双链DNA的5'序列与3'序列之间插入至少两个以上的待测序DNA片段，这样就能够在测序步骤中从所述双链DNA的两端同时读取两个待测序DNA片段的数据，从而能够减少测序试剂用量、缩短测序用时。即，基于上述认识的本专利技术包括：1.一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库的方法，其包括：步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，所述希望进行测序的DNA片段是孕妇外周血中的游离DNA；步骤B-1：将平末端DNA片段中的至少一部分进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段；和步骤B-2：将步骤B-1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接。2.根据项1所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：在所述步骤B-2之后或与所述步骤B-2同时进行的步骤C：将所述步骤B-2中的所述平末端连接的产物加接头，得到加接头DNA片段；和在所述步骤C之后进行的步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。3.根据项1或2所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：在所述步骤D之后进行的步骤E：对所述扩增产物进行片段选择。4.根据项1～3中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：在所述步骤E之后进行的步骤F：对经过片段选择后的扩增产物进行纯化。5.根据项1～4中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：在所述步骤C之后进行的步骤C1：对所述加接头DNA片段进行片段选择；且在所述步骤D中将经过片段选择的加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。6.根据项1～5中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其中，选择出包含至少两个以上的希望进行测序的DNA片段的扩增产物。7.一种用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库，其中，包含至少两个以上希望进行测序的DNA片段的双链DNA占全部双链DNA的至少10mol％。8.根据项7所述的二代测序用DNA文库，其是采用项1-6中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法构建的。9.一种用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒，其包含具有3'端加A功能的DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶的量少于常规的用于构建的二代测序DNA文库的试剂盒中包含的该酶的量。10.根据项9所述的试剂盒，其中，所述具有3'端加A功能的DNA聚合酶是缺失3'端到5'端外切酶活性的Klenow酶片段。专利技术效果采用构建二代测序用DNA文库的方法构建的二代测序用DNA文库所包含的用于测序的双链DNA中，5'序列与3'序列之间允许插入至少两个以上的待测序DNA片段，这使得在采用双端测序模式的情况下，能够在一个测序流程中同时从用于测序的双链DNA的两端读取数据，从而能够减少测序试剂用量、缩短测序用时，因而能够降低测序成本、提高测序效率。同时，单3'端加A技术节省了构建文库使用的试剂，降低了构建DNA文库及测序的成本。附图说明图1是本专利技术的文库构建流程与传统文库构建流程的对比说明图；图2是实施例2采用安捷伦2100生物分析仪检测DNA文库片段大小结果示意图；图3是实施例3的双端测序碱基分布图；图4是实施例3的单端测序碱基分布图；图5是实施例3的双端测序质量分布图；图6是实施例3的单端测序质量分布图。专利技术的具体实施方式首先，在一个方面中，本专利技术提供一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库的方法(本专利技术的构建二代测序用DNA文库的方法)，其包括：步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，所述希望进行测序的DNA片段是孕妇外周血中的游离DNA；步骤B-1：将平末端DNA片段进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段；和步骤B-2：将步骤B-1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接。如图1的右图所示，在传统的构建二代测序用DNA文库的方法中，是将经过末端修复而得到的平末端DNA片段进行双3'端加A，而本专利技术的构建二代测序用DNA文库的方法与传统不同的是：将经过末端修复而得到的平末端DNA片段进行单3'本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库的方法，其包括：步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，所述希望进行测序的DNA片段是孕妇外周血中的游离DNA；步骤B‑1：将平末端DNA片段中的至少一部分进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段；和步骤B‑2：将步骤B‑1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接。

【技术特征摘要】
1.一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库的方法，其包括：步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，所述希望进行测序的DNA片段是孕妇外周血中的游离DNA；步骤B-1：将平末端DNA片段中的至少一部分进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段；和步骤B-2：将步骤B-1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接。2.根据权利要求1所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：在所述步骤B-2之后或与所述步骤B-2同时进行的步骤C：将所述步骤B-2中的所述平末端连接的产物加接头，得到加接头DNA片段；和在所述步骤C之后进行的步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。3.根据权利要求1或2所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：在所述步骤D之后进行的步骤E：对所述扩增产物进行片段选择。4.根据权利要求1～3中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：在所述步骤E之后进行的步骤F：对经过片段选择后的扩增产物进行纯化。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈重建，夏赟，彭琼芳，王占东，薛月寒，玄兆伶，李大为，梁峻彬，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11