利用等位基因特异性抑制序列变体的核酸扩增制造技术

本发明专利技术涉及利用等位基因特异性抑制序列变体的核酸扩增。本发明专利技术是选择性扩增目标序列的某些变体的改进方法，其通过等位基因特异性的抑制目标序列的一种或多种其它变体的扩增来得到增强。这种改进通过提供与目标序列的需要变体的杂交亲和力低于与目标序列的不需要变体的杂交亲和力的寡核苷酸，和任选通过提供化学修饰的引物和热启动条件来实现。

【技术实现步骤摘要】
利用等位基因特异性抑制序列变体的核酸扩增本申请是国际申请日为2010年1月7日的国际申请PCT/EP2010/000030进入中国、申请号为201080004356.2的题为“利用等位基因特异性抑制序列变体的核酸扩增”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及基于核酸的分子诊断领域，更具体地说，本专利技术涉及利用等位基因特异性抑制不需要序列变体扩增的核酸序列扩增的改进方法。
技术介绍
基于核酸的诊断测试广泛地用于医学、法医学和环境应用中。检测特定核酸序列中的变异提供关于多态性和突变(包括致病突变)的信息。例如，检测个体的突变基因型为遗传咨询提供携带者的状态。一个更具挑战性的任务是检测源于组织并引起疾病或疾病发展的体细胞突变。例如，许多癌症由特定突变引起。随后，在肿瘤进展期间，其它的突变积累存在于癌细胞中。参见Lea等(2007)Geneticpathwaysandmutationprofilesofhumancancers：siteandexposure-specificpatterns，Carcinogenesis，28(9)：1851-1858；Downward，J.(2003)TargetingRASsignalingpathwaysincancertherapy(2005)，NatureRev.Cancer，3：11-22。这些突变预示疾病结果和对治疗的响应。参见Ikediobi等(2008)Somaticpharmacogenomicsincancer，PharmacogenomicsJ.，8：305-314；Pao等(2005)KRASmutationsandprimaryresistanceoflungadenocarcinomastogefitinibandorerlotinib，PLoSMedicine，2(1)，e17。检测这种突变的能力对癌症诊断和治疗极其有用。然而，突变的检测，尤其是早期检测面临很多技术难题。检测癌症相关突变的主要难题是其罕见的性质，特别是癌发生中突变刚出现于单细胞时。最初，只有部分细胞携带突变，而周围细胞仍然携带野生型序列。因此在核酸的分离物中，新突变的核酸隐藏于过量的野生型核酸中。许多等位基因特异性检测方法(例如等位基因特异性PCR)包括相对于不需要的序列(野生型序列)，优先扩增目标序列(突变序列)。不幸的是，多数情况下该方法的选择性并不完美，即不需要序列也被扩增，虽然比所需要序列的扩增效率低很多。因为存在的不需要(野生型)序列的摩尔数大大超过突变序列，其扩增劣势被消除，并且野生型序列被显著扩增从而遮蔽了存在的突变序列。已经开发了应对该难题的一些方法。例如，美国专利号5,849,497和2008年8月5日申请的申请顺序号12/186,311教导了利用防止竞争性不需要序列的扩增的扩增阻断剂。在该方法中，阻断剂是在一个扩增引物的下游与不需要序列(但是不与所需序列)形成稳定杂交体的不可延伸的寡核苷酸。当阻断剂稳定杂交后，缺乏5’-3’核酸酶活性的DNA聚合酶不能完成引物的延伸。该方法的成功依赖于需要序列和不需要序列间的序列差异。该方法最好用于序列之间有多个差异的情形下，以确保阻断剂和待抑制序列之间的杂交稳定，而阻断剂和待扩增序列之间的杂交不稳定。上述方法有几个技术局限。较长的阻断剂寡核苷酸对阻断更有效，但可能不能区分差异，因此阻断了所有序列变体的扩增。较短的阻断剂可能不能有效阻断任何扩增。在某些序列组成中，可能差异很少以至于阻断剂只能进行非常微弱的区分。因此，在某些有临床意义的基因座中，仅阻断剂还不足以解决等位基因特异性扩增的技术问题。
技术实现思路
本专利技术是对目标序列的需要变体进行选择性扩增的改进方法，其中所述目标序列以多种变体形式存在，该方法包括如下步骤：提供在反应混合物中可能包含至少一种目标序列变体的样品；提供能和目标序列的多种变体杂交的第一寡核苷酸；提供能和目标序列的多种变体杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的至少一部分在3’末端或3’末端附近的一个或多个核苷酸中包含修饰的碱基；提供第三寡核苷酸，其与所述目标序列的需要变体杂交的亲和力低于与目标序列的不需要变体杂交的亲和力，并设计为与所述第二寡核苷酸杂交相同的链且位于所述第二寡核苷酸下游0-60个核苷酸之间的位置；提供基本上没有5’-3’核酸酶活性和具有热启动能力的核酸聚合酶；使所述反应混合物进行聚合酶链式反应，其中当所述第三寡核苷酸杂交目标序列的不需要变体时，所述第三寡核苷酸显著抑制所述核酸聚合酶对所述第二寡核苷酸的延伸，但是当所述第三寡核苷酸杂交于目标序列的需要变体时，其基本上不抑制所述核酸聚合酶对所述第二寡核苷酸的延伸。附图说明图1是本专利技术方法的示意图。图2图示根据本专利技术的实施例1，分别扩增和解链分析野生型和KRAS突变靶的结果。图3-8图示根据本专利技术的实施例2，在野生型和突变体样品的混合物中，等位基因特异性扩增和检测KRAS突变的结果。图9图示根据本专利技术的实施例3，在得自患者的福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)样品中，等位基因特异性扩增和检测KRAS突变的结果。图10图示本专利技术的实施例中使用的目标核酸序列。具体实施方式本专利技术是选择性扩增目标序列的某些变体的改进方法，其通过等位基因特异性抑制目标序列的一种或多种其它变体的扩增而得到增强。定义除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解一致的含义。在描述本专利技术和主张本专利技术权利中，将使用以下的定义。“生物样品”或“样品”指可能包含目的核酸的任何物质。本领域技术人员可用公知的任何方法获得样品。这样的样品可以是从人或其它动物分离的一定量的组织或液体，或其纯化部分，包括但不限于：体液(例如血浆、血清、脊髓液、唾液、腹水、淋巴液、水性或玻璃体液、滑液、尿液、眼泪、精液、阴道液体、肺积液、浆膜液)和组织(包括血液、正常组织、肿瘤和石蜡包埋组织)。样品也可以是(或来自于)体外细胞培养物。样品可以包括条件培养液(medium)、细胞和细胞组分。核酸可用本领域公知的方法从生物样品中获得。本文所用“阻断剂寡核苷酸”指下列描述的寡核苷酸：(1)以足够低的解链温度和目标序列的某些变体形成双链体，以允许显著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶移除(displace)阻断剂寡核苷酸，使目标序列的那些变体得以复制；和(2)以足够高的解链温度和目标序列的其它变体形成双链体，以削弱显著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶复制目标序列的那些变体。阻断剂寡核苷酸通常在3’末端包含修饰以防止阻断剂寡核苷酸通过聚合酶延伸。“目标序列”指生物样品中待检测的核苷酸序列。目标序列可以是较大序列或分离的核酸的一部分。短语“削弱扩增”指消除或可检测地减少序列的扩增。如本文所述，和缺乏阻断剂寡核苷酸的对照反应相比，阻断剂寡核苷酸可以削弱目标序列的一种或多种变体的扩增，使得这些变体的扩增检测不到，或较少检测到。术语“核酸”和“多核苷酸”可交替使用，指RNA、DNA和其修饰形式(例如肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)等)的聚合体。术语“核酸”和“多核苷酸”之间的长度并无有意的区分。“寡核苷酸”通常是较短的核酸，其常为单链。核酸是单链或双链，通常包含磷酸二酯键，虽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性扩增目标序列的需要变体的方法，所述目标序列以多种变体形式存在，所述方法包括以下步骤：a)在反应混合物中提供可能包含所述目标序列的至少一种变体的样品；b)提供能与所述目标序列的多种变体杂交的第一寡核苷酸；c)提供能与所述目标序列的多种变体杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的至少部分在3’末端或其附近的一个或多个核苷酸中包含修饰的碱基，且其中所述修饰的碱基是于环外氨基基团的修饰；d)提供第三寡核苷酸，其与所述目标序列的需要变体杂交的亲和力低于与所述目标序列的不需要变体杂交的亲和力，并设计为与所述第二寡核苷酸杂交相同的链且位于所述第二寡核苷酸下游0‑60个核苷酸之间；e)提供基本上没有5’‑3’核酸酶活性的核酸聚合酶；f)使所述反应混合物进行聚合酶链式反应，其中所述第一和第二寡核苷酸的量是不相等的，从而使得第一寡核苷酸过量存在；并且当所述第三寡核苷酸杂交于所述目标序列的不需要变体时，所述第三寡核苷酸显著抑制所述核酸聚合酶对所述第二寡核苷酸的延伸，但是当所述第三寡核苷酸杂交于所述目标序列的需要变体时，其基本上不抑制所述核酸聚合酶对所述第二寡核苷酸的延伸。

【技术特征摘要】
2009.01.07 US 61/1431131.一种选择性扩增目标序列的需要变体的方法，所述目标序列以多种变体形式存在，所述方法包括以下步骤：a)在反应混合物中提供可能包含所述目标序列的至少一种变体的样品；b)提供能与所述目标序列的多种变体杂交的第一寡核苷酸；c)提供能与所述目标序列的多种变体杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的至少部分在3’末端或其附近的一个或多个核苷酸中包含修饰的碱基，且其中所述修饰的碱基是于环外氨基基团的修饰；d)提供第三寡核苷酸，其与所述目标序列的需要变体杂交的亲和力低于与所述目标序列的不需要变体杂交的亲和力，并设计为与所述第二寡核苷酸杂交相同的链且位于所述第二寡核苷酸下游0-60个核苷酸之间；e)提供基本上没有5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶；f)使所述反应混合物进行聚合酶链式反应，其中所述第一和第二寡核苷酸的量是不相等的，从而使得第一寡核苷酸过量存在；并且当所述第三寡核苷酸杂交于所述目标序列的不需要变体时，所述第三寡核苷酸显著抑制所述核酸聚合酶对所述第二寡核苷酸的延伸，但是当所述第三寡核苷酸杂交于所述目标序列的需要变体时，其基本上不抑制所述核酸聚合酶对所述第二寡核苷酸的延伸。2.权利要求1的方法，其中所述第一、第二和第三寡核苷酸中的至少一种是标记的。3.权利要求1的方法，其还包括检测扩增的核酸序列。4.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸是SEQIDNO:2，所述第二寡核苷酸是SEQIDNO:3和/或所述第三寡核苷酸是SEQIDNO:5。5.权利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶具有热启动能力。6.一种用于选择性扩增目标序列的需要变体的反应混合物，所述目标序列以多种变体形式存在，所述混合物包括：a)能与所述目标序列的多种变体杂交的第一寡核苷酸；b)能与所述目标序列的多种变体杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的至少部分在3’末端或其附近的一个或多个核苷酸中包含修饰的碱基，且其中所述修饰的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M格罗，V布罗菲，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH