用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用。本发明专利技术基于最小核心基因组(minimum core genome,MCG)分型技术，通过筛选每个MCG Group中特有的单核苷酸多态性(SNP)位点，获得用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记，所述核心SNP标记分别位于布鲁氏菌基因BOV_0551和基因BOV_A0392上，并设计引物对分离菌株进行简便和高效的鉴定，可应用于布病病原监测和流行病学分析，为布病防控提供新的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用。
技术介绍
布鲁氏菌是一种细胞内寄生的革兰阴性球杆菌，引起布鲁氏菌病(简称布病)。布病是一个世界范围内重要的人兽共患病，给流行地区和国家造成巨大的经济损失并严重危害人类健康。2006年以前布鲁氏菌分为6个种，共19个生物型，包括牛种(Brucellaabortus)8个生物型、羊种(Brucellamelitensis)3个生物型、猪种(Brucellasuis)5个生物型、犬种(Brucellacanis)、绵羊附睾种(Brucellaovis)和沙漠森林野鼠种(Brucellaneotomae)各1个生物型。目前布鲁氏菌种增加了5个新种：Brucellaceti(分离自鲸鱼和海豚)、Brucellapinnipedialis(分离自鳍足类)、Brucellamicroti(分离自田鼠)、Brucellainopinata(分离自乳房移植病人的血液和伤口分泌液)和Brucellapapionis(分离自狒狒)。在国内，引起人(动物)布病的病原体主要是羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌，病原体的准确鉴定是控制与根除布病的关键。传统的布鲁氏菌种及生物型的鉴定是依据菌株生长CO2的需求试验、硫化氢产生试验、噬菌体裂解试验、硫堇和碱性复红染料抑菌试验和单项特异性血清(A、M和R血清)凝集试验，这种生物分型方法是金标准，其缺点是操作复杂，需要的时间长。基于敏感、特异、快速的PCR技术的分子生物学方法具有广阔的应用前景。目前文献报道的PCR方法很多，其中主要是以BCSP3l、Bp26和VirB8基因为依据而设计的属水平鉴定用PCR方法，种内生物型水平上的鉴定主要有AMOS—PCR方法、多重PCR方法和多位点串联重复序列分析方法(MLVA)。近10年的布鲁氏菌分离鉴定显示，羊种菌仍然是当前的主要流行菌，其次是牛种菌。这两种菌是我国人(畜)间布病流行的主要病原菌，为了更好地加强我国布病病原监测能力，提高病原检测水平，设计一种简便、快速、特异、而低费用的PCR方法对布鲁氏菌进行鉴定，最终为判定和处置疫情提供强有力的技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记及其应用。本专利技术基于以下构思：随着测序技术的发展，全基因组在布鲁氏菌的进化和分类研究中已得到越来越多的应用。尽管如此，由于布鲁氏菌各个种之间DNA的高度相似性，不同布鲁氏菌种间的关系以及进化顺序等问题一直没有统一的观点。现在已有许多学者应用布鲁氏菌的全基因组测序数据和方法对布鲁氏菌进行毒力、进化等方面的分析，但是中国布鲁氏菌的测序数量和分析仍然稀缺，我国作为全球布鲁氏菌病疫情较为严重的国家之一，对我国布鲁氏菌株的全基因组测序和方法的探索显得尤为迫切和重要。最小核心基因组(minimumcoregenome,MCG)分型方法是一种基于全基因组数据进行的分析方法，该方法是将所有菌株共有的基因定义为MCG基因，然后查找MCG基因上的单核苷酸多态性位点(SNP)定义为MCGSNP，根据MCGSNP对所有菌株进行分组和聚类，进而对细菌的种群结构进行分析。本专利技术通过筛选每个MCGGroup中特有的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点，用于我国布鲁氏菌流行株的鉴别，对于布鲁氏菌的快速识别和鉴定具有重要的意义。目前国内外尚未有将最小核心组分型方法系统应用于布鲁氏菌分型研究的报道，本专利技术为布鲁氏菌的分型分析提供了新思路。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记，其特征在于，所述核心SNP标记分别位于布鲁氏菌基因BOV_0551和基因BOV_A0392上；其中布鲁氏菌基因BOV_0551序列的第565962、566005、566081和566095处碱基分别为T、A、C和A鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为C、G、T和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQIDNO:1-2所示；布鲁氏菌基因BOV_A0392序列的第413407、413580、413581和413597处碱基分别为C、A、G和G鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为T、G、A和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQIDNO:3-4所示。以上位点的参考序列为绵羊副睾种布鲁氏菌。本专利技术还提供用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的引物对，包括正向引物BOV_0551-F5’-CGGTACTGGAAGGCTTCGATAAAG-3’和反向引物BOV_0551-R5'-TCAGAAAGATTTCAATGCGGATGT-3'。本专利技术还提供用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的引物对，包括正向引物BOV_A0392-F5’-ATGCTTGCCCATGACCTCATCC-3’和反向引物BOV_A0392-R5'-TCAAATCCCAGCCAGTCTTTTC-3'。本专利技术还提供所述核心SNP标记在鉴别羊种和牛种布鲁氏菌中的应用，包括以下步骤：1)提取待测样品的基因组DNA；2)以上述提取的基因组DNA为模板，利用SEQIDNO:1-2所示引物，和/或利用EQIDNO:3-4所示引物，通过PCR反应分别扩增出含有所述核心SNP标记的DNA片段；3)检测PCR扩增产物。PCR反应的扩增体系(20μl)：100nMDNA模板0.5μl，10μM正向引物和反向引物各0.4μl，2×PCRMIX10μl，余量为水。PCR反应的扩增程序为：95℃2分钟；95℃2分钟，58℃30秒，72℃30秒，30个循环。步骤3)中检测PCR扩增产物采用测序法。本专利技术还提供含有所述引物对BOV_A0392-F/R和/或BOV_0551-F/R的用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。本专利技术首次基于布鲁氏菌全基因组SNP信息，筛选得到羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌鉴定用SNP，并设计引物对分离菌株进行简便和高效的鉴定，可应用于布病病原监测和流行病学分析，为布病防控提供新的技术支撑。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(一)所选靶序列是根据中国流行菌株和国际参考菌株全基因组比教获得的，保证筛选得到的SNP位点更特异。(二)筛选得到了两对用于鉴别羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌的引物，使鉴定具有选择性。(三)一次PCR反应经测序，可以获得丰富的SNP位点信息，使鉴定更高效。附图说明图1为本专利技术实施例2中两对引物检测敏感性评价结果。图2为本专利技术实施例3中两对引物检测地方布鲁氏菌菌株结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1用于鉴别羊种本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记，其特征在于，所述核心SNP标记分别位于布鲁氏菌基因BOV_0551和基因BOV_A0392上；其中布鲁氏菌基因BOV_0551序列的第565962、566005、566081和566095处碱基分别为T、A、C和A鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为C、G、T和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQ ID NO:1‑2所示；布鲁氏菌基因BOV_A0392序列的第413407、413580、413581和413597处碱基分别为C、A、G和G鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为T、G、A和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQ ID NO:3‑4所示；以上位点的参考序列为绵羊副睾种布鲁氏菌。

【技术特征摘要】
1.用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心SNP标记，其特征在于，所述核心SNP标记分别位于布鲁氏菌基因BOV_0551和基因BOV_A0392上；其中布鲁氏菌基因BOV_0551序列的第565962、566005、566081和566095处碱基分别为T、A、C和A鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为C、G、T和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQIDNO:1-2所示；布鲁氏菌基因BOV_A0392序列的第413407、413580、413581和413597处碱基分别为C、A、G和G鉴定为牛种布鲁氏菌，上述4个位点处碱基分别为T、G、A和C鉴定为羊种布鲁氏菌，扩增含有上述4个SNP标记的DNA片段的引物序列如SEQIDNO:3-4所示；以上位点的参考序列为绵羊副睾种布鲁氏菌。2.用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的引物对，其特征在于，包括正向引物BOV_0551-F5’-CGGTACTGGAAGGCTTCGATAAAG-3’和反向引物BOV_0551-R5'-TCAGAAAGATTTCAATGCGGATGT-3'。3.用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的引物对，其特征在于，包括正向引物BOV_A0392-F5’-ATGCTTGCCCATGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜海，张雯，赵娜，崔步云，朴东日，赵鸿雁，田国忠，狄栋栋，范伟兴，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11