一种用于检测光滑假丝酵母菌LAMP引物组合物及其LAMP检测试剂盒和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测光滑假丝酵母菌的LAMP引物组合物、基于该引物组合物的检测试剂盒及检测方法，试剂盒中包括LAMP引物组合物、Bst DNA聚合酶和显色剂等；显色剂为荧光染料SYBGreen或荧光指示剂Syto 9；本发明专利技术的LAMP引物组合物在光滑假丝酵母菌的特异内源性基因处设计了四条引物，具有很强的品系特异性，保证了反应的顺利进行。此外本发明专利技术的试剂盒还具有操作简便、反应快速高效、特异性和灵敏度高、鉴定方法多样等优点，适合在临床中推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测光滑假丝酵母菌LAMP引物组合物及其LAMP检测试剂盒和使用方法
本专利技术涉及真菌病原分子检测
，尤其涉及一种用于检测光滑假丝酵母菌的环介导等温扩增试剂盒及使用方法。
技术介绍
近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤药物和免疫抑制剂等的广泛应用，器官移植、骨髓移植、导管插管等的普遍开展，尤其是艾滋病等的流行，致使真菌尤其是念珠菌引起的深部感染机会日益增多。念珠菌是一种芽生的酵母状真菌。已知可以致病的常见念珠菌有：白念、热带、近平滑、克鲁斯、星状、季也蒙和光滑念珠菌等八种。这些菌不仅广泛存在于自然界里，而且也可寄生在正常人体皮肤、口咽、胃肠道、肛门和阴道粘膜上而不发生疾病，是一种典型的条件致病菌。念珠菌感染是由念珠菌属，尤其是白念珠菌引起的一种真菌性广谱病变。该病病原菌既可侵犯皮肤、粘膜和指(趾)甲等引起的浅部念珠菌病，又能累及内脏、系统甚至播散导致深部念珠菌感染。随着免疫受损或低下人群的不断扩大。机会性念珠菌病继续增多，迄今仍是医学真菌领域研究的热点。光滑假丝酵母菌是属于白念珠菌的一种，该真菌既可侵犯皮肤、粘膜和指(趾)甲等引起的浅部念珠菌病，又能侵入内脏，导致深部念珠菌感染。光滑假丝酵母菌也是口腔黏膜的重要病原真菌，由其引起的口腔感染占艾滋病患者口腔念珠菌感染的14％。有研究表明，光滑假丝酵母菌是分离自尿液的第2位常见病原真菌和引起外阴阴道念珠菌病(VVC)最常见的非白念珠菌。从VVC患者病灶部位分离的念珠菌中，光滑假丝酵母菌占34.5％。与其他非白念珠菌相比，光滑假丝酵母菌感染的病死率最高，为40％-70％，肿瘤患者和骨髓移植患者发生的光滑假丝酵母菌血症的病死率分别高达50％和100％。目前临床应用的光滑假丝酵母菌的检测方法可以分为三大类：形态学方法、血清学方法、分子生物学方法。形态学方法需要培养光滑假丝酵母菌而该真菌的培养周期一般需要数天甚至数周；菌种鉴定也较困难，需要交给具有丰富的经验的专业技术人员判断，而这限制了病情的早期诊断，易贻误最好的治疗时机。血清学方法包括抗原检测和抗体检测。念珠菌的抗原成分复杂，与自然界中的多种物质，如血红蛋白、白蛋白、血透用硝酸纤维膜、多糖类免疫调节剂、细菌、其他真菌、类风湿因子等存在广泛的交叉，抗原检测易导致假阳性结果；念珠菌感染患者多合并有免疫抑制，抗体反应低下，可能导致假阴性的结果。而且，机体产生抗体反应需要一定的时间，因此抗体检测不能用于早期诊断。分子生物学技术的发展为深部真菌感染的早期诊断创造了条件，目前应用于临床诊断的主要是PCR技术。包括以PCR为基础衍生出的多种技术：包括反转录PCR(RT-PCR)、多重PCR、巢式PCR、RAPD技术、实时荧光定量PCR等。然而，PCR操作过程比较复杂，需要专业人员操作，并不是所有医院都具有该专业技术人员。另外，PCR仪价格昂贵，扩增时间长。因此，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的试剂盒及使用方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的技术问题，提供了一种用于检测光滑假丝酵母菌的LAMP引物组合物、基于上述引物组合物的光滑假丝酵母菌检测试剂盒以及试剂盒的使用方法。所述LAMP引物组合物包括正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP和反向内引物BIP。光滑假丝酵母菌检测试剂盒使用所述LAMP引物组合物。该试剂盒操作方法简便，不需要复杂的仪器，也不需要特殊的试剂。反应时间快速高效，45-60min即可获得结果。结果的鉴定方法非常简便，既能够直接肉眼观察反应液浑浊度，也可以加入荧光染料SYBGreen或荧光指示剂Syto9。本专利技术适用于现场检测。为了实现上述技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于检测光滑假丝酵母菌的LAMP引物组合物，包括：正向外引物F3：5’-GAGACAAGCAATTCAAATCAAGGA-3’(SEQIDNO:1)；反向外引物B3：5’-CGGCATCACCAGTACTCTTG-3’(SEQIDNO:2)；正向内引物FIP：5’-TGGGTCGTCTTCTGAAGGAACATCATCCAAAGAAAAGATTCAATGCTGTT-3(SEQIDNO:3)反向内引物BIP：5’-TCCAGAGGTGGTTGTGGTAACACTGCTACCCACAAGTTTCAAACC-3’(SEQIDNO:4)。另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测光滑假丝酵母菌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测光滑假丝酵母菌的LAMP引物组合物。优选地，引物组合物中正向外引物F3浓度为50μM，反向外引物B3浓度为50μM，正向内引物FIP浓度为50μM，反向内引物BIP为50μM。优选地，所述试剂盒还包括BstDNA聚合酶，dNTP，10×IsothermalAmplification反应缓冲液，MgSO4，H2O，显色剂。进一步地，BstDNA聚合酶的浓度为8U/μL，dNTP浓度为12mM，MgSO4浓度为150mM。进一步地，所述显色剂为荧光染料SYBGreen或荧光指示剂Syto9。另一方面，本专利技术还提供一种检测光滑假丝酵母菌的方法，检测方法使用用于检测光滑假丝酵母菌的LAMP引物组合物。进一步地，检测光滑假丝酵母菌的方法包括以下步骤：步骤一：将待检测样品煮沸后离心，吸取上清，得到样品DNA；步骤二：在PCR管中依次加入引物组合物，样品DNA，dNTP，10×IsothermalAmplification反应缓冲液，MgSO4水溶液，BstDNA聚合酶和H2O，得到反应液；步骤三：将带有反应液的PCR管60～65℃反应45～60min；步骤四：根据PCR管反应液浑浊程度判断扩增结果。此外，本专利技术还提供了另一种检测光滑假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：步骤一：将待检测样品煮沸后离心，吸取上清，得到待检样品DNA；步骤二：在PCR管中依次加入引物组合物，光滑假丝酵母菌DNA，dNTP，10×IsothermalAmplification反应缓冲液，MgSO4水溶液，BstDNA聚合酶和H2O，得到反应液；步骤三：将带有反应液的PCR管放入水浴锅反应；步骤四：向PCR管反应液内加入荧光染料SYBGreen或荧光指示剂Syto9，根据荧光强度判断扩增结果。为了进一步优化上述检测光滑假丝酵母菌的方法，本专利技术所提供的技术措施还包括：步骤一中待测样品可以为真菌培养物、疑似病变组织或组织渗出液，煮沸时间为10min，离心速度为10000g/min；步骤二中反应液的反应体系为：1μL待检样品DNA，4μL12mMdNTP，2.5μL10×IsothermalAmplification反应缓冲液，1μL150mMMgSO4水溶液，1μLBstDNA聚合酶和14.5μLH2O；步骤三中将带有反应液的PCR管放入60～65℃的水浴锅中，反应时间为45-60min；步骤四中加入的显色剂为2μL。本专利技术提供了一种光滑假丝酵母菌环介导等温扩增试剂盒及使用方法，相对于现有技术，具有如下技术效果：本专利技术基于环介导等温扩增技术LAMP法，在光滑假丝酵母菌的特异内源性基因处设计了四条特异性引物，具有很强的品系特异性，且非常稳定，保证了反应的顺利进行。整个操作过程简便，即使非专业人员也能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测光滑假丝酵母菌的LAMP引物组合物，其特征在于，所述LAMP引物组合物包括：正向外引物F3：5’‑GAGACAAGCAATTCAAATCAAGGA‑3’；反向外引物B3：5’‑CGGCATCACCAGTACTCTTG‑3’；正向内引物FIP：5’‑TGGGTCGTCTTCTGAAGGAACATCATCCAAAGAAAAGATTCAATGCTGTT‑3反向内引物BIP：5’‑TCCAGAGGTGGTTGTGGTAACACTGCTACCCACAAGTTTCAAACC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测光滑假丝酵母菌的LAMP引物组合物，其特征在于，所述LAMP引物组合物包括：正向外引物F3：5’-GAGACAAGCAATTCAAATCAAGGA-3’；反向外引物B3：5’-CGGCATCACCAGTACTCTTG-3’；正向内引物FIP：5’-TGGGTCGTCTTCTGAAGGAACATCATCCAAAGAAAAGATTCAATGCTGTT-3反向内引物BIP：5’-TCCAGAGGTGGTTGTGGTAACACTGCTACCCACAAGTTTCAAACC-3’。2.一种用于检测光滑假丝酵母菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，正向外引物F3浓度为50μM，反向外引物B3浓度为50μM，正向内引物FIP浓度为50μM，反向内引物BIP为50μM。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括BstDNA聚合酶，dNTP，10×IsothermalAmplification反应缓冲液，MgSO4，H2O，显色剂。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂为荧光染料SYBGreen或荧光指示剂Syto9。6.一种检测光滑假丝酵母菌的方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的引物组合物。7.根据权利要求6所述检测光滑假丝酵母菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将待检测样品煮沸...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文娟，方雪恩，王丽娟，郭建，李杨，孔继烈，
申请(专利权)人：上海市东方医院，上海速创诊断产品有限公司，复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31