一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测血吸虫DNA的方法，将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增得到扩增产物，用荧光探针法对扩增产物进行实时检测；所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物；所述等温扩增的温度为35～45℃；所述等温扩增的时间为5～20min；本发明专利技术提供的方法不依赖热循环仪，操作简单，能够在较低的温度(35～45℃)下对血吸虫DNA进行检测，并且扩增所用时间短(5～20min)，适合基层和现场检测。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法
本专利技术涉及分子生物学检测领域，尤其涉及一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法。
技术介绍
日本血吸虫病是世界性分布的人兽共患寄生虫病，是世界卫生组织(WHO)界定的“六大热带病之一”，也是我国五大寄生虫病之一。日本血吸虫病是由尾蚴感染接触疫水的人和动物等终宿主引起的。幼虫在终宿主体内通过吸收宿主营养发育，造成宿主营养不良；通过转变抗原、抗原伪装和减弱宿主的免疫力等途径来抵抗宿主免疫的杀伤作用，逐渐发育至成虫，寄生于门脉-肠系膜静脉系统。急性期症状表现为发热、肝肿大、腹痛、腹泻和便血等；慢性期症状主要表现为肝脾肿大或慢性腹泻；晚期，主要与肝脏门静脉周围纤维化有关，临床表现为巨脾、腹水等。日本血吸虫(Schistosomajaponicum)属于扁形动物门、吸虫纲、复殖目、裂体科、裂体属、日本种，雌雄异体。雄虫平均长13mm，雌虫平均长15mm。虫卵圆形，淡黄色，卵壳薄，无盖，在其侧方有一小刺，成熟的卵内含毛蚴。毛蚴呈长椭圆形，卵内毛蚴在水中孵出，侵入钉螺，钉螺是其唯一的中间宿主，所以日本血吸虫病的流行地理分布和钉螺的地理分布相一致，有一定的地方性。血吸虫的基因组由8对染色体组成，其中7对为常染色体，1对性染色体。在我国血吸虫病的病原是日本血吸虫，我国血吸虫病主要分布在江苏、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、广西、广东、福建等12个省的433个县(市、区)，共有钉螺面积148亿平方米，累计感染者达1160万例，受威胁人口在1亿以上。我国的血吸虫病经过60年的积极防治，全国的血吸虫病疫情已得到有效控制，但近年来由于生物、自然、社会经济、人口流动、政策保障等因素变化较大，一些地方呈现血吸虫病疫情扩散蔓延的态势，表现为老疫区血吸虫病患者增加，钉螺扩散明显，新钉螺区出现，感染性钉螺分布范围扩大，部分已达血吸虫病传播控制和传播阻断的地区可能出现疫情回升，各地输入性血吸虫病病例增加，我国的血吸虫病防治工作还任重道远。在血吸虫病的防控中，诊断与检测工作显得更为重要，它为防治活动的计划、实施和防治效果评价等个环节提供必要的信息和科学依据。用于血吸虫诊断的方法主要有病原学诊断、免疫学诊断和超声诊断等，但是传统的血吸虫检测方法检测周期长、漏检率高、程序复杂、检测结果滞后，已经远远不能满足现代的检测要求。近年来，随着科学技术的发展，特别是分子生物学的不断发展，国内外研究学者已经建立了较多快速、灵敏以核酸为基础的血吸虫检测方法，目前已有多种日本血吸虫的核酸诊断方法包括PCR，Q-PCR以及LAMP等检测方法。PCR及Q-PCR法依赖于热循环仪器，对操作环境及人员有较高的要求，并且耗时长，而LAMP法的问题在于扩增产物对环境的污染，会导致假阳性的出现，对操作环境及操作技巧的要求更高，这些方法不适合在基层单位和现场检测中的应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种操作简单、耗时短、易于检测结果的低温血吸虫DNA检测方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种检测血吸虫DNA的方法，包括以下步骤：将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物；所述血吸虫DNA特异性引物包括正向引物和反向引物：正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；所述荧光探针序列为：5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’所述等温扩增的温度为35～45℃；所述等温扩增的时间为5～20min。优选的，所述扩增体系包括以下浓度的组分：Tris缓冲液(0～60]mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量浓度为5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP1～6mM、dNTPs0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白300～1000ng/μL、重组酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30-200ng/μL、荧光探针50-150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM。优选的，所述聚乙二醇的分子量为30000～40000。优选的，所述扩增体系的体积为25～100μL。优选的，所述血吸虫DNA的体积为0.5～1.5μL，浓度为10～100ng/μL。优选的，所述等温扩增在恒温条件下进行，所述等温扩增的温度为37～42℃。优选的，所述等温扩增的时间为10～20min。优选的，所述扩增体系由冷冻干燥粉末状态的扩增体系原料溶解得到，用于溶解所述扩增体系原料的溶剂为反应缓冲液。优选的，所述反应缓冲液为质量浓度为5.5～6.5％、分子量为30000～40000的聚乙二醇水溶液。本专利技术还提供了一种检测血吸虫DNA的等温扩增体系，包括以下含量的组分：Tris缓冲液(0～60]mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量浓度为5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP1～6mM、dNTPs0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白300～1000ng/μL、重组酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30-200ng/μL、荧光探针50-150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM；正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；所述荧光探针序列为：5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’本专利技术的有益效果：本专利技术提供的检测血吸虫DNA的方法，采用扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；所述扩增体系中包括Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物，本专利技术的扩增体系可以在恒定的相对较低的温度下完成扩增，不依赖热循环仪，操作简单，能够在较低的温度(35～45℃)下对血吸虫DNA进行检测，并且扩增所用时间短(5～20min)，荧光信号易于收集，适合基层和现场检测。附图说明图1为血吸虫DNA检测过程中阴性和阳性的荧光信号变化曲线图。具体实施方式本专利技术提供了一种检测血吸虫DNA的方法，包括以下步骤：将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物；所述血吸虫DNA特异性引物包括正向引物和反向引物：正向引物序列：5’‑TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG‑3’,反向引物序列：5’‑ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG‑3’；所述荧光探针序列为：5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA‑3’所述等温扩增的温度为35～45℃；所述等温扩增的时间为5～20min。

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物；所述血吸虫DNA特异性引物包括正向引物和反向引物：正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；所述荧光探针序列为：5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’所述等温扩增的温度为35～45℃；所述等温扩增的时间为5～20min。2.根据权利要求1所述的检测血吸虫DNA方法，其特征在于，所述扩增体系包括以下浓度的组分：Tris缓冲液(0～60]mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量浓度为5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP1～6mM、dNTPs0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白300～1000ng/μL、重组酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30～200ng/μL、荧光探针50～150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM。3.根据权利要求1或2所述的检测血吸虫DNA方法，其特征在于，所述聚乙二醇的数均分子量为30000～40000。4.根据权利要求1或2所述的检测血吸虫DNA方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵松，杨坤，李伟，张键锋，羊海涛，郭利川，刘小曼，王智宏，应清界，
申请(专利权)人：江苏省血吸虫病防治研究所，江苏奇天基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32