续随子二萜烷型化合物的转化制备方法技术

本发明专利技术涉及生物药物领域，涉及续随子二萜烷型化合物的转化方法，本发明专利技术利用已知微生物对续随子二萜醇及其衍生物进行微生物转化，结合化学酰基化，制备了续随子二萜烷型衍生物化合物，尤其是采用卷枝毛霉菌CICC40242微生物对续随子二萜醇、大戟因子L3进行羟基化生物转化，并在C8与C18引入的羟基进行化学酰基化，得到3个羟基化产物和6个C8醇酯化产物。所述位点的羟基化能提高大戟因子L3的水溶性，提高成药性。进一步，制得的续随子烷型二萜衍生物化合物可制备抗肿瘤活性与抗肿瘤多药耐药性得药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
续随子二萜烷型化合物的转化制备方法
本专利技术属生物药物领域，涉及续随子二萜烷型化合物的转化方法，具体涉及利用已知微生物对续随子二萜醇及其衍生物进行微生物转化，结合化学酰基化，制备续随子二萜烷型衍生物的方法。
技术介绍
现有技术公开了续随子二萜烷型化合物属于二萜骨架的天然产物，具有较明显的抗肿瘤活性与抗肿瘤多药耐药性(MDR)。构效关系研究表明，其母核上取代基的差异能明显改变该类化合物的抗肿瘤活性和MDR活性。研究公开了续随子二萜烷型化合物是从大戟科植物续随子EuphorbialathyrisL.中首次分离得到(TetrahedronLetters,1971,18:1325-1328)。随后从其他植物中陆续分离得到多种续随子二萜烷型衍生物，如从大戟科植物Euphorbialagascae中分离得到5个具有诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤多药耐药性的续随子二萜醇酯衍生物(PlantaMedica,2005,72:162-168)。此外对这些从植物中分离得到的续随子二萜烷型衍生物也进行了进一步化学反应修饰，得到14个抗肿瘤多药耐药性更高效的衍生物(Bioorganic&MedicinalChemistry,2014,22:6392-6400)。虽然已经从植物中分离得到多种结构丰富的续随子二萜烷型化合物，但至今尚未获得其低活性碳发生羟基化的续随子二萜烷型产物。该二萜骨架类型化合物的C-8位和C-18位为低活性位点，难以用化学方法接上羟基，而羟基是此类化合物进一步合成修饰的良好起始基团。微生物转化是利用微生物生长过程中合成的特异酶完成特定生化反应。据报道，微生物在生长过程中可以合成多种酶，催化不同反应，例如氧化反应、还原反应、水解反应、脱氢反应、缩合反应和开环反应等，这类酶催化反应具有特异性和高效性，相对于化学反应，在底物的非活性碳原子上进行反应更高效环保。因此，利用微生物对续随子二萜烷型化合物进行转化研究，以期获得一些难以用传统化学合成制备的特异位点(尤其是C-8和C-18低活性碳位点)的转化产物，并结合化学合成法，对微生物转化产物进一步进行化学修饰，迄今为止尚未见有关续随子二萜类化合物的微生物转化研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供续随子二萜烷型化合物非活性碳上进行结构改造的方法，尤其是制备具有生理活性、化学反应无法羟基化的续随子二萜烷型类化合物的微生物转化方法。本专利技术使用卷枝毛霉MucorcircinelloidesCICC40242分别对续随子二萜醇(Lathyrol)和大戟因子L3(EuphorbiaFactorL3)进行了微生物转化或生物转化组合化学酰化，获得以下结构通式的续随子烷型二萜衍生物：经鉴定，所获得的续随子烷型二萜衍生物化合物为：化合物18α-羟基大戟因子L3：R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝OH,R4＝H化合物218-羟基大戟因子L3：R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝H,R4＝OH化合物38α-羟基续随子二萜醇：R1＝R2＝OH,R3＝OH,R4＝H化合物48α-乙酰氧基大戟因子L3：R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝OAc,R4＝H化合物58α-苯甲酰氧基大戟因子L3：R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝OBz,R4＝H化合物68α-环丙甲酰氧基大戟因子L3：R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝R4＝H化合物78α-烟酰氧基大戟因子L3：R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝R4＝H化合物88α-对氟苯甲酰氧基大戟因子L3：R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝R4＝H化合物98α-(3)-呋喃甲酰氧基大戟因子L3：R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝R4＝H本专利技术中所述的微生物转化法包括以下步骤：(1)生产菌株为卷枝毛霉MucorcircinelloidesCICC40242，该菌株在琼脂培养基上生长良好，将生长在琼脂培养基上的卷枝毛霉菌丝划线接种于马铃薯固体培养基上，在20-28℃的恒温培养箱中培养3-7天，得到试管种；其中，所述卷枝毛霉Mucorcircinelloides菌种微生物还包括其功能等同的变异体和突变体；(2)将试管种中的菌丝接种到250mL的三角瓶中，每瓶含有50mL液体马铃薯培养基，培养温度为25-28℃，转速为130-180rpm，培养时间为24小时，获得种子液；(3)将种子液按2％～5％体积比接入新鲜马铃薯培养基，28℃，130-180rpm条件下培养24-72小时后，加入转化底物续随子二萜醇或大戟因子L3,在20-28℃、130-180rpm的条件下转化培养72-240小时；本专利技术的一个实施例中，优选将卷枝毛霉CICC40242种子液按1％-3％体积比接入马铃薯培养基，28℃培养12-48小时，再加入5mg/mL大戟因子L3或续随子二萜醇的乙醇溶液；(4)将发酵液用布氏漏斗减压过滤，获得发酵滤液，按照1:1.5体积比用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压蒸干，发酵产物用硅胶柱层析法分离得到大戟因子L3的发酵产物8α-羟基大戟因子L3(1)和18-羟基大戟因子L3(2)；续随子二萜醇的转化产物8α-羟基续随子二萜醇(3)；其中，所述的液体培养基包括组分：200g马铃薯去皮，切成1立方厘米小丁，经1L水微沸煎煮20分钟，随后用8层纱布趁热过滤，放凉后滤液用水补齐到1L，加入20g葡萄糖，搅拌溶解；分装后121℃高压灭菌20分钟后，放凉使用；其中，所述的固体培养基包含组分：液体培养基加入1％琼脂，加热溶解并分装，121℃高压灭菌20分钟后，放凉使用。本专利技术中，大戟因子L3经卷枝毛霉CICC40242转化反应所得的8α-羟基大戟因子L3(1)进行化学酰化，酰化反应物包括乙酰氯、苯甲酰氯、环丙甲酰氯、烟酰氯、3-呋喃甲酰氯和对氟苯甲酰氯。本专利技术中，所述的生物转化组合化学酰化法，包括以下步骤：1)制备8α-乙酰氧基大戟因子L3(4)：将10-15mg的8α-羟基大戟因子L3(1)溶于无水四氢呋喃，滴加1-2滴三乙胺，1-2mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，磁力搅拌混合均匀，投入1.5当量的乙酰氯，反应10-15小时，加入碳酸氢钠饱和溶液终止反应，用乙酸乙酯萃取，溶剂回收后用制备液相分离，流动相比例为75％甲醇-水；2)制备8α-苯甲酰基大戟因子L3(5)：将10-15mg的8α-羟基大戟因子L3(1)溶于无水四氢呋喃，滴加1-2滴三乙胺，1-2mgDMAP，磁力搅拌混合均匀，投入1.5当量的苯甲酰氯，反应10-15小时，加入碳酸氢钠饱和溶液终止反应，用乙酸乙酯萃取，溶剂回收后用制备液相分离，流动相比例为75％甲醇-水；3)制备8α-环丙甲酰氧基大戟因子L3(6)：将10-15mg的8α-羟基大戟因子L3(1)溶于无水四氢呋喃，滴加1-2滴三乙胺，1-2mgDMAP，磁力搅拌混合均匀，投入1.5当量的环丙甲酰氯，加热回流反应10-15小时，加入碳酸氢钠饱和溶液终止反应，用乙酸乙酯萃取，溶剂回收后用制备液相分离，流动相比例为75％甲醇-水；4)制备8α-烟酰氧基大戟因子L3(7)：将10-15mg的8α-羟基大戟因子L3(1)溶于无水四氢呋喃，滴加1-2滴三乙胺，1-2mgDMAP，磁力搅拌混合均匀，投入1.5当量的烟酰氯盐酸盐，加热回流反应10本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有下列通式的续随子二萜烷型化合物的转化制备方法，其特征在于：用卷枝毛霉Mucor circinelloides菌种微生物(保藏号为CICC 40242)或其功能等同的变异体和突变体，对续随子二萜醇、大戟因子L3进行微生物转化或生物转化组合化学酰化，获得下式的续随子二萜烷型化合物：

【技术特征摘要】
1.具有下列通式的续随子二萜烷型化合物的转化制备方法，其特征在于：用卷枝毛霉Mucorcircinelloides菌种微生物(保藏号为CICC40242)或其功能等同的变异体和突变体，对续随子二萜醇、大戟因子L3进行微生物转化或生物转化组合化学酰化，获得下式的续随子二萜烷型化合物：其中，化合物1：8α-羟基大戟因子L3，R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝OH,R4＝H化合物2：18-羟基大戟因子L3，R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝H,R4＝OH化合物3：8α-羟基续随子二萜醇，R1＝R2＝OH,R3＝OH,R4＝H化合物4：8α-乙酰氧基大戟因子L3,R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝OAc,R4＝H化合物5：8α-苯甲酰氧基大戟因子L3，R1＝OBz,R2＝OAc,R3＝OBz,R4＝H化合物6：8α-环丙甲酰氧基大戟因子L3，R1＝OBz,R2＝OAc,R4＝H化合物7：8α-烟酰氧基大戟因子L3，R1＝OBz,R2＝OAc,R4＝H化合物8：8α-对氟苯甲酰氧基大戟因子L3，R1＝OBz,R2＝OAc,R4＝H化合物9：8α-(3)-呋喃甲酰氧基大戟因子L3，R1＝OBz,R2＝OAc,R4＝H；按微生物转化法：其中包括步骤：(1)将生长在琼脂培养基上的卷枝毛霉菌株MucorcircinelloidesCICC40242菌丝划线接种于马铃薯固体培养基上，在20-28℃的恒温培养箱中培养3-7天，得到试管种；(2)将试管种中的菌丝接种到三角瓶中，每瓶含有液体马铃薯培养基，培养温度为25-28℃，转速为130-180rpm，培养时间为24小时，获得种子液；(3)将种子液按2％～5％体积比接入新鲜马铃薯培养基，28℃，130-180rpm条件下培养24-72小时后，加入转化底物续随子二萜醇或大戟因子L3,在20-28℃、130-180rpm的条件下转化培养72-240小时；(4)将发酵液用布氏漏斗减压过滤，获得发酵滤液，按照1:1.5体积比用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压蒸干，发酵产物用硅胶柱层析法分离得到大戟因子L3的发酵产物8α-羟基大戟因子L3(1)和18-羟基大戟因子L3(2)；续随子二萜醇的转化产物8α-羟基续随子二萜醇(3)；进一步，按生物转化组合化学酰化法，其包括步骤：1)制备8α-乙酰氧基大戟因子L3(4)：将8α-羟基大戟因子L3(1)溶于无水四氢呋喃，滴加三乙胺，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，磁力搅拌混合均匀，投入1.5当量的乙酰氯，反应10-15小时，加入碳酸氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：程志红，吴亦晴，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31