一种使用纳米探针穿入细胞核的方法技术

该发明专利技术公开了一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，涉及细胞生物学与细胞转染领域，首先通过FIB技术加工一种高长径比的纳米探针，同时在细胞膜表面添加一层鼠尾胶原蛋白以此减少细胞骨架对纳米探针的扰动，然后利用该纳米探针与单个细胞作用记录所有的力曲线，最后利用编写的程序自动化分析力曲线，判断纳米探针是否穿透了细胞核，并记录需要读取的数据。利用该方法可以自动化地对力曲线进行系统分析，不仅可以减少人力，而且这些数据的统计分析对未来纳米技术智能穿透细胞核有重要的参考意义。

【技术实现步骤摘要】
一种使用纳米探针穿入细胞核的方法
本专利技术涉及细胞生物学与细胞转染领域。
技术介绍
细胞转染方法分为生物转染(慢病毒转染和腺病毒转染)、化学转染(脂质体转染)和物理转染(电穿孔、显微注射和纳米探针技术)，每种方法都有各自的优缺点。目前普遍使用的方法是生物转染和化学转染方法，但是转染后的细胞存在癌变风险，而且细胞毒性增大。以上两种方法最大的缺陷在于转染效率非常低，不超过0.1％。物理转染方法安全可靠，这也是近几年大量科学家研究细胞转染的重要方法。在物理转染方法中，电穿孔可以高通量的对细胞进行转染，但是高电压会造成大量的细胞死亡，并且转染过程不可控；显微注射法可以在时间和空间上对细胞进行可控转染，但是很难对贴壁细胞进行直接转染。目前更多的研究者开始关注基于纳米探针技术的细胞转染方法。该方法可以实现直接对贴壁细胞进行单细胞转染，时间和空间可控，可原位观察转染后细胞的生物学特性。日本在2008年首先提出了利用一种高长径比的纳米探针来穿透细胞核，并在随后很多年一直从事这方面的研究，证明了这种纳米探针对细胞转染的可靠性。该方法转染效率高，但是问题在于，这种高长径比的纳米探针非常敏感，在刺入细胞的时候容易和细胞骨架相互作用使得得到的力曲线抖动很大(图1)，这在很大程度上增加了力曲线分析的难度。而且目前对力曲线的数据读取几乎靠人力，数据量庞大，迄今为止都没有研究团队对实验中穿透细胞核的力曲线参数如刺穿力、刺穿位置、力曲线跳变大小等做过系统的统计，这会阻碍利用纳米技术智能化转染细胞的进程。
技术实现思路
本专利技术针对
技术介绍
的不足之处设计一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，解决现有技术中纳米探针穿刺成功率低的问题。本专利技术技术方案为首先需要在试验前对细胞进行处理，在一定程度上“固定”细胞骨架，减少其对探针的扰动以得到较为标准的力曲线；本专利技术将细胞膜表面添加鼠尾胶原蛋白是为了让鼠尾胶原蛋白和细胞膜表面的跨膜蛋白作用，而跨膜蛋白又和细胞内的细胞骨架相互作用。通过这种间接的作用可以一定程度上“固定”细胞骨架，以减少探针在穿透细胞过程中骨架对探针的扰动，从而得到较为平滑的力曲线。其次是编写相应程序利用计算机智能读取穿透细胞核的力曲线数据，以此全面了解探针穿透细胞核的过程，为下一步智能化转染细胞提供依据。因此本专利技术一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，该方法包括：步骤1：对现有纳米探针进行加工；步骤1.1：获取待加工金字塔形氮化硅探针的俯视图形区域，计算出该俯视图形的轮廓；步骤1.2：采用离子束沿俯视图形的轮廓线逐层剥落金字塔形氮化硅探针各腰面的氮化硅；步骤1.3：当加工后探针的俯视图形的轮廓与原金字塔形氮化硅探针的针尖轮廓重合时停止进一步加工；获得纳米探针。步骤2：对待穿透细胞进行处理：将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于待穿透细胞的细胞膜表面；步骤3：进行细胞穿透；步骤3.1：将探针对准待穿入的细胞核，进行下针，检测探针上受力情况；步骤3.2：监测探针受力变化，若探针出现两次受力突变则判断探针穿入了细胞核。进一步的，所述步骤1.2中采用电压为60kv,束流为0.28nA的离子束沿俯视图形的轮廓线逐层剥落金字塔形氮化硅探针各腰面的氮化硅；进一步的，所述步骤1完成的纳米细针高度为6μm,直径为200nm。进一步的，所述步骤2的具体方法为：步骤2.1：配制HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液；步骤2.1.1：将HEPES粉末溶于灭菌的三蒸水中，获得HEPES溶液，每100ml灭菌的三蒸水中溶解1.2gHEPES粉末；步骤2.1.2：用孔径为0.2uM的过滤器过滤步骤1.1获得的HEPES溶液，将过滤后的溶液密封冷藏放置；步骤2.2：配制0.2mg/ml鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的溶液；将鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液与步骤1获得的HEPES溶液混合，并且使混合溶液中的鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的浓度为0.2mg/ml；步骤2.3：取目标细胞培养溶液，去除细胞培养溶液中的培养液，获得目标细胞；步骤2.4：用步骤2获得的混合溶液浸没步骤3获得的目标细胞，静置一段时间，使混合溶液中的鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于细胞表面；步骤2.5：去除剩余的鼠尾胶原蛋白Ⅰ型溶液，获得附着有鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的目标细胞；步骤2.6：将步骤5获得的附着有鼠尾胶原Ⅰ型蛋白的目标细胞置于培养液中培养至少24个小时。本专利技术首先将细胞膜表面添加鼠尾胶原蛋白是为了让鼠尾胶原蛋白和细胞膜表面的跨膜蛋白作用，而跨膜蛋白又和细胞内的细胞骨架相互作用；通过这种间接的作用可以一定程度上“固定”细胞骨架，以减少探针在穿透细胞过程中骨架对探针的扰动，从而得到较为平滑的力曲线，从而达到了增加探针穿入细胞核概率的效果。附图说明图1为日本团队利用高长径比的纳米探针穿透单细胞的力曲线；图2为培养皿中人成纤维细胞(左)，单个成纤维细胞(右)；图3为FIB加工金字塔形的氮化硅针尖,(b)商业化的金字塔形氮化硅针尖,(c)FIB加工的氮化硅纳米细针；图4为探针和单细胞作用图；图5为探针与单细胞作用的力曲线及探针与单细胞作用的示意图。具体实施方式1.人皮肤成纤维细胞(Fibroblasts简称“FB”)的培养方法FB培养在35mm直径的培养皿中，培养液为DMEM/HIGHGIUCOSE((高糖)含丙酮酸钠)和10％的胎牛血清(FBS)，细胞培养在37℃,5％CO2的孵箱中，至少培育24小时。图2为培养皿中的人成纤维细胞和原子力显微镜得到的单个成纤维细胞形貌图。2.FIB技术加工纳米细针实验用的纳米细针是在商业化的金字塔形氮化硅探针的基础上利用FIB技术加工而成的(图3(a))。FIB技术加工纳米细针是通过强电流离子束对原始探针(图3(b))进行剥离,最后加工成高长径比，直径为200nm的纳米细针(图3(c))。具体加工步骤如下：1)选取预加工的图形结构，如图3(a)黄色区域所示；2)调整离子束(Ga)工作状态使其图像最为清晰；3)选取合适的图形生成模版，使生成的图形结构与预加工的图形结构轮廓吻合；4)开启离子束(Ga)进行加工，加工电压为60kv,束流为0.28nA，同时沿着图3(a)黑色箭头的方向剥离材料；5)随着加工的进行,逐渐缩小黄色图形结构,使其与样品针尖轮廓吻合，最终即可得到所需要的图形结构(图3(c))。加工成型的纳米细针(图3(c))，保留了原有探针的高度6μm,但是直径仅有200nm。3.细胞膜表面添加一层鼠尾胶原Ⅰ型蛋白鼠尾胶原Ⅰ型蛋白本来的用处是铺展在培养皿上以增加细胞的粘附性。这里在细胞膜表面添加鼠尾胶原蛋白是为了让鼠尾胶原蛋白和细胞膜表面的跨膜蛋白作用，而跨膜蛋白又和细胞内的细胞骨架相互作用。通过这种间接的作用可以一定程度上“固定”细胞骨架，以减少探针在穿透细胞过程中骨架对探针的扰动，从而得到较为平滑的力曲线。过程如下：1)、0.05mol/mlHEPES溶液的配制①用电子天平称量1.2g的HEPES粉末；②在无菌操作工作台中，将1.2g的HEPES粉末溶于100ml灭菌的三蒸水中；③将上述溶液用一次性孔径为0.2μm过滤器过滤置培养瓶中，再用封口膜将瓶口封住放置4℃冰箱备用。2)、0.2mg/ml鼠尾胶原的配制①在无菌操作工作台中，取1mlHEPES(0.05mol/ml)溶液于1.5ml灭菌的EP管中；②在上述溶液中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，该方法包括：步骤1：对现有纳米探针进行加工；步骤1.1：获取待加工金字塔形氮化硅探针的俯视图形区域，计算出该俯视图形的轮廓；步骤1.2：采用离子束沿俯视图形的轮廓线逐层剥落金字塔形氮化硅探针各腰面的氮化硅；步骤1.3：当加工后探针的俯视图形的轮廓与原金字塔形氮化硅探针的针尖轮廓重合时停止进一步加工；获得纳米探针；步骤2：对待穿透细胞进行处理：将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于待穿透细胞的细胞膜表面；步骤3：进行细胞穿透；步骤3.1：将探针对准待穿入的细胞核，进行下针，检测探针上受力情况；步骤3.2：监测探针受力变化，若探针出现两次受力突变则判断探针穿入了细胞核。

【技术特征摘要】
1.一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，该方法包括：步骤1：对现有纳米探针进行加工；步骤1.1：获取待加工金字塔形氮化硅探针的俯视图形区域，计算出该俯视图形的轮廓；步骤1.2：采用离子束沿俯视图形的轮廓线逐层剥落金字塔形氮化硅探针各腰面的氮化硅；步骤1.3：当加工后探针的俯视图形的轮廓与原金字塔形氮化硅探针的针尖轮廓重合时停止进一步加工；获得纳米探针；步骤2：对待穿透细胞进行处理：将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于待穿透细胞的细胞膜表面；步骤3：进行细胞穿透；步骤3.1：将探针对准待穿入的细胞核，进行下针，检测探针上受力情况；步骤3.2：监测探针受力变化，若探针出现两次受力突变则判断探针穿入了细胞核。2.如权利要求1所述的一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，其特征在于所述步骤1.2中采用电压为60kv,束流为0.28nA的离子束沿俯视图形的轮廓线逐层剥落金字塔形氮化硅探针各腰面的氮化硅。3.如权利要求1所述的一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，其特征在于所述步骤1完成的纳米细针高度为6μm,直径为200nm。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：范娜，彭倍，王贵学，冉小琳，王群，王学明，刘一钊，陈佳，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：四川,51