评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用。本发明专利技术所提供的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体，由N种报告基因表达载体组成，N种报告基因表达载体中每种报告基因表达载体均携带一种转录因子的顺式作用元件；N种报告基因表达载体间的区别仅在于所携带的转录因子的顺式作用元件不同；N种报告基因表达载体均为质粒a；N为大于等于2的一个自然数。本发明专利技术可用于定量检测中药及其他天然药物对于不同通路中的关键转录因子的影响，进而判断其对不同通路的影响，从分子水平的角度解释中药及其他天然药物的作用机制，为现有中药及其他天然药物的作用机制不明确、靶点多样性的问题提供解决方案。

【技术实现步骤摘要】
评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用
本专利技术涉及生物技术应用领域中评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用。
技术介绍
中医药是中华民族传统优秀文化的重要组成部分，历经几千年的传承与发展，已形成了其独特的理论体系及科学的思维方法，其确切的疗效早已被长期的临床实践所验证；另外，与中医药有着密切联系的天然药物在十八世纪以前一直在人类的疾病治疗中扮演主要角色，可以说是伴随着人类社会存在而存在的。随着现代医学及化学制药工业的迅速发展，西药以其起效快、作用机制明确等优点逐渐占据主流市场。而传统医药则大多数情况下成了人们在西医西药无法治疗情况下的“替补”。在传统医药与现代医药的这场较量中，拥有悠久历史及丰富资源的中药及其他天然药物并未保住其历史地位，这其中很重要的一条原因就是其起效成分、治病机理不明确，导致其难以被大部分人认可。因此，研究清楚中药及其他天然药物的起效成分、作用机制非常重要，是中药及天然药物现代化发展的重要必经环节。然而中药等自身成分的复杂性及其作用靶点的不确定性为其确切作用机制的研究带来了巨大困难，其研究进展一直很缓慢。报告基因(Reportergene)是一种编码易于被检测的蛋白质或酶的基因。该基因序列可以插入到基因表达调节序列(如启动子、增强子)之后形成嵌合基因，或与其他目的基因序列相连接形成融合蛋白的基因序列，进而通过检测该报告基因的表达来定性或定量测定目的基因的表达情况。常用的报告基因有氯霉素转乙酰酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶以及荧光蛋白等。转录因子(transcriptionfactor)是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。顺式作用元件是指与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。本申请的专利技术人刘长振等(郭志兰,车路阳,李晶哲,等.NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证.生物工程学报,2016,32(10):1465–1473)为了定量检测NF-κB的活化效果及筛选与NF-κB活化调控相关的药物，通过去除逆转录病毒载体pQCXIP原有的CMV启动子，并分别插入NF-κB增强子序列及荧光素酶NanoLuc报告基因序列，构建了一种新的含有NF-κB增强子序列和NanoLuc(NLuc)报告基因序列的表达载体pQCXIP-NF-κB-NLuc，但是pQCXIP-NF-κB-NLuc与pVSV-G病毒包装质粒侵染GP2-293细胞得到的病毒转染HeLa后，得到的稳定表达克隆较少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是如何检测中药和/或天然药物的起效成分(有效成分或活性成分)和/或中药和/或天然药物的作用机制。本专利技术中，天然药物是指动物、植物和矿物等自然界中存在的有药理活性的天然产物；中药是在中医药学理论指导下应用的,具有治疗和/或保健作用的药物，包括中药材、中药饮片、中药提取物和中成药。为解决上述技术问题，本专利技术提供了检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体。本专利技术所提供的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体，由N种报告基因表达载体组成，所述N种报告基因表达载体中每种报告基因表达载体均携带一种转录因子的顺式作用元件；所述N种报告基因表达载体间的区别仅在于所携带的转录因子的顺式作用元件不同；所述N种报告基因表达载体均为质粒a；所述质粒a是将序列1的第4191-6364位核苷酸替换为名称为K的DNA片段得到的质粒；所述名称为K的DNA片段包括转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因；所述N为大于等于2的一个自然数。上述成套载体中，所述名称为K的DNA片段具体可为F1、F2或F3：F1、所述名称为K的DNA片段由转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因连接而成；F2、所述名称为K的DNA片段由转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA、真核生物抗性筛选标记基因和与所述报告基因相连的标签序列连接而成；F3、所述名称为K的DNA片段还包括与所述报告基因相连的标签序列；所述标签序列编码标签蛋白。上述成套载体中，序列1是由7183bp组成的环状质粒，是一种逆转录病毒表达载体，其名称为pIMP-NF-κB。pIMP-NF-κB携带NF-κB的顺式作用元件，序列1的第4191-4230位核苷酸为转录因子NF-κB的顺式作用元件；序列1的第4239-4299位核苷酸为TATAlike启动子，序列1的第4313-4909位核苷酸为报告基因NanoLuc，序列1的第5765-6364位核苷酸为真核生物抗性筛选标记基因嘌呤霉素抗性基因(puoR)。上述成套载体中，为了使所述报告基因表达的报告蛋白质便于检测，所述名称为K的DNA片段还包括与所述报告基因相连的标签序列；所述标签序列编码标签蛋白。所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His6标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白、SUMO标签蛋白。Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽，其氨基酸序列为DYKDDDDK。His6标签蛋白是由六个组氨酸残基组成的多肽；可插入在目的蛋白的C末端或N末端。MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。上述成套载体中，所述TATAlike启动子是位于转录起点上游，包含TATA盒保守序列TATA(A/T)A(A/T)，并且发挥类似经典TATA盒启动子功能，控制转录起始的准确性及频率的一段序列。所述TATAlike启动子具体可为L1)、L2)或L3)的DNA片段：L1)、核苷酸序列为序列1的第4239-4299位核苷酸；L2)与序列1的第4239-4299位核苷酸具有75％或75％以上一致性，且具有启动子功能的DNA片段；L3)在严格条件下与L1)或L2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。上述成套载体中，所述转录因子可为所有可特异性结合其顺式作用元件并促进或抑制下游基因转录的转录因子，如NF-κB、SP1、STAT3、FOXO、AP1、ATFs、Nrf2&Nrf1、ATF6、CBF、PPAR、p53、CREB、AR、C/EBP、E2F、EGR1、ER、GATA、GR、HSF、HNF4、MTF1、TCF/LEF、GL1、HIF1、IRF1、KLF4、LXRa、Elk-1/SRF、MEF2、Myc/Max、Nanog、RBP-Jk、Oct4、Pax6、NFAT、ProgesteroneReceptor(PR)、RetinoicAcidReceptor(RAR)、RetinoidXReceptor(RXR)、Sox2、SMA本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体，由N种报告基因表达载体组成，所述N种报告基因表达载体中每种报告基因表达载体均携带一种转录因子的顺式作用元件；所述N种报告基因表达载体间的区别仅在于所携带的转录因子的顺式作用元件不同；所述N种报告基因表达载体均为质粒a；所述质粒a是将序列1的第4191‑6364位核苷酸替换为名称为K的DNA片段得到的质粒；所述名称为K的DNA片段包括转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237‑5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因；所述N为大于等于2的一个自然数。

【技术特征摘要】
1.检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的成套载体，由N种报告基因表达载体组成，所述N种报告基因表达载体中每种报告基因表达载体均携带一种转录因子的顺式作用元件；所述N种报告基因表达载体间的区别仅在于所携带的转录因子的顺式作用元件不同；所述N种报告基因表达载体均为质粒a；所述质粒a是将序列1的第4191-6364位核苷酸替换为名称为K的DNA片段得到的质粒；所述名称为K的DNA片段包括转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因；所述N为大于等于2的一个自然数。2.根据权利要求1所述的成套载体，其特征在于：所述名称为K的DNA片段为F1、F2或F3：F1、所述名称为K的DNA片段由转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA和真核生物抗性筛选标记基因连接而成；F2、所述名称为K的DNA片段由转录因子的顺式作用元件、TATAlike启动子、报告基因、序列1的第5237-5743位核苷酸所示的DNA、真核生物抗性筛选标记基因和与所述报告基因相连的标签序列连接而成；所述标签序列编码标签蛋白；F3、所述名称为K的DNA片段还包括与所述报告基因相连的标签序列；所述标签序列编码标签蛋白。3.根据权利要求1或2所述的成套载体，其特征在于：所述TATAlike启动子为L1)、L2)或L3)的DNA片段：L1)、核苷酸序列为序列1的第4239-4299位核苷酸；L2)与序列1的第4239-4299位核苷酸具有75％或75％以上一致性，且具有启动子功能的DNA片段；L3)在严格条件下与L1)或L2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。4.检测中药和/或天然药物对N种转录因子的影响的系统，为s1或s2：s1、包括权利要求1-3中任一所述的成套载体的病毒包装系统；s2、由包括所述成套载体的病毒包装系统包装得到的病毒和所述病毒的宿主细胞组成的系统；所述N为大于等于2的一个自然数。5.根据权利要求1-3中任一所述的成套载体或权利要求4所述的检测中药和/或天然药物对N种转录因子的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长振，郭志兰，李晶哲，
申请(专利权)人：中国中医科学院医学实验中心，
类型：发明
国别省市：北京,11