B淋巴瘤和白血病的检测标记物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属医药技术领域，具体为B淋巴瘤和白血病的检测标记物、试剂盒及其应用。本发明专利技术提供P4HA2基因或蛋白和Carabin蛋白在制备诊断试剂或治疗B淋巴瘤和白血病的用途。研究表明，P4HA2基因和蛋白在正常人或反应增生淋巴结中几乎不表达或低表达，而在弥散性大B淋巴瘤中显著高表达；而Carabin蛋白在弥散性大B淋巴瘤中低表达。另外，P4HA2基因在急性髓性白血病血液样本中的表达量显著高于正常人；敲低P4HA2表达的弥散性大B淋巴瘤细胞株增殖减慢，裸鼠成瘤能力显著降低；因此，P4HA2可作为这类造血及淋巴肿瘤的诊断标记物及治疗靶标，而Carabin也可作为该类疾病的诊断标记物。本发明专利技术还提供相应的检测方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
B淋巴瘤和白血病的检测标记物、试剂盒及其应用
本专利技术属医药
，具体涉及B淋巴瘤或白血病的检测标记物、试剂盒及其在制备抗肿瘤药物的用途。
技术介绍
哺乳动物细胞中催化脯氨酸残基的是脯氨酰-4-羟化酶（P4H），产生(2S,4R)-4-羟基脯氨酸。脯氨酰-4-羟化酶具有广泛的底物，其中最为重要的是催化新合成的胶原蛋白前体，对其折叠形成正确的三维构象是关键且必要的。底物哺乳动物的脯氨酰-4-羟化酶是一个α2β2的四聚体，其α亚基具有底物结合结构域和酶活位点。α亚基具有3种亚型，一型亚基(prolyl4-hydroxylase,alphapolypeptideⅠ,简称为“P4HA1”)是表达最为广谱的酶。脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基(prolyl4-hydroxylase,alphapolypeptideII,简称为“P4HA2”)，由535个氨基酸组成，在某些特异组织表达。P4ha1-/-基因敲除小鼠胚胎致死，但P4ha1+/-或P4ha2-/-基因敲除的小鼠没有观察到明显异常的表型，并且敲除P4ha1+/-和P4ha2-/-的小鼠软骨发育不良。近来研究表明，P4HA2基因（而非P4HA1）的异常与疾病紧密相关，该基因的突变伴随着非综合征性高度近视疾病，且P4HA2基因的一个内含子区域在中国吸烟人群中是肺癌易感位点。除此而外，有报道指出P4HA1和P4HA2在乳腺癌中高表达，并通过调节胶原蛋白的构象参与乳腺癌恶性转移。但是，未见P4HA1和P4HA2与弥散性大B淋巴瘤或白血病相关的报道。Carabin是TBC1蛋白家族的成员，前期研究表明，Carabin在脾脏和外周血淋巴细胞中表达，并负调控T细胞抗原受体（TcellantigenreceptorTCR）信号通路。进一步研究发现Carabin是钙依赖磷酸酶Calcineurin的内源性抑制因子。除此之外，它还通过其RasGAP活性抑制Ras信号通路。Carabin对Calcineurin和Ras通路的调控是因为通过直接与Ras以及Calcineurin相互作用而实现的。另外，Carabin还可以通过同样的机制负调控B细胞的BCR信号通路，抑制Carabin的表达可以加快B细胞的早期应答。最近，在敲除Carabin的小鼠中发现Carabin与心肌肥厚有关，也是通过抑制Calcineurin、Ras和Ca2+/钙依赖性蛋白激酶2信号通路防止心肌肥厚。但是，未见文献报导Carabin蛋白在B淋巴瘤中的表达情况及其相关性。B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其中，弥散性大B淋巴瘤是最为常见的非霍奇金淋巴瘤淋巴瘤,占成人非霍奇金淋巴瘤病例的1/3以上，其侵袭能力较强，恶性程度较高。弥散性大B淋巴瘤又分为GCB（germinalcentreB-cell）、ABC和PMBL型，GCB型5年总生存率为76%，而非GCB型的5年总生存率仅为34%。目前，临床上对B淋巴瘤尤其是弥散性大B淋巴瘤病人采用CHOP或R-CHOP的标准治疗方案。虽然有超过50%的病人能够被此治疗方案治愈，但仍至少有1/3以上的病人难以治疗或者复发。对这类病人将采用自体造血干细胞移植，从而使其对标准治疗方案的化疗药物敏感，但收效甚微。因此,寻找新的具有B淋巴瘤诊断或联合诊断价值的，特异高表达的基因或蛋白质有着重要的诊断和治疗意义。白血病与淋巴瘤同属于影响血液、骨髓与淋巴系统肿瘤当中的一种，此大类疾病被称为造血和淋巴组织肿瘤（Tumorsofthehematopoieticandlymphoidtissues）。在恶性肿瘤死亡率中，白血病居第6位(男性)和第8位(女性)，在儿童及35岁以下成人中则居第l位。最近10年来，白血病的发病率是此前的两倍。目前全国白血病患者已达400多万人，每年新增4万人，且儿童占到了一半。白血病可被分为急性淋巴性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、慢性淋巴性白血病（CLL）和慢性骨髓性白血病（CML）这四大类型，以及其他一些较不常见的种类。临床上，我国急性白血病比慢性白血病多见，急性白血病由于恶性细胞的剧增和扩散，必须立即治疗，否则病人在数月甚至数周内死亡。其中成人以AML最多，而儿童中比较常见的是ALL。白血病是最常见的儿童癌症。AML是一种具有高度异质性的疾病，根据细胞形态学和组织化学特征可将AML分为不同的类型。目前对于AML的治疗仍以联合化疗为主，AML患者总的完全缓解率仅50%～70%，长期无病生存率为25%～30%。因此，发现和开发新的白血病标记物对于白血病的精确分型、诊断、预后以及最佳治疗方案的选择有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种可用于检测B淋巴瘤或白血病的特异标记物、诊断试剂盒及其在制备抗肿瘤药物中用途。具体地讲，本专利技术提供了脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基（P4HA2）的基因、mRNA、cDNA或蛋白的用途及TBC1结构域家族成员10C蛋白的用途，它们被用作：（1）检测B淋巴瘤或白血病的标记物；（2）制备检测B淋巴瘤或白血病的试剂盒试剂盒；（3）治疗B淋巴瘤的分子靶标，并制备有关抗肿瘤药物。本专利技术提供的可作为B淋巴瘤或白血病的标记物,为脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基（P4HA2）的基因（SEQ.ID.NO1（Gene:P4HA2;CDS:565..2172））、mRNA（SEQ.ID.NO2（Gene:P4HA2;mRNA:1..2588））、cDNA或蛋白（SEQ.ID.NO3（Protein:P4HA2;protein_id="NP_004190.1"）），以及TBC1结构域家族成员10C的基因（Carabin基因）（SEQ.ID.NO4）、mRNA（SEQ.ID.NO5）、cDNA或蛋白（SEQ.ID.NO6）。研究表明，P4HA2基因和蛋白在正常人或反应增生淋巴结中几乎不表达或低表达，而在弥散性大B淋巴瘤中显著高表达；而Carabin蛋白在弥散性大B淋巴瘤中低表达。另外，P4HA2基因在急性髓性白血病血液样本中的表达量显著高于正常人。敲低P4HA2表达的弥散性大B淋巴瘤细胞株增殖减慢，裸鼠成瘤能力显著降低；而敲低Carabin的弥散性大B淋巴瘤细胞株增殖加快，裸鼠成瘤能力显著提高。因此，P4HA2可作为这类造血及淋巴肿瘤的诊断标记物及治疗靶标，而Carabin也可作为该类疾病的诊断标记物。在本专利技术的具体实施例中，通过免疫组化的方法，用P4HA2蛋白抗体，检测了205例弥散性大B淋巴瘤和20例反应增生淋巴结的组织样。发现P4HA2在反应增生淋巴结的组织样中几乎不表达或表达水平很低，而在多数弥散性大B淋巴瘤中表达，并且P4HA2的表达和弥散性大B淋巴瘤的分型及国际预后指数（InternationalPrognosticIndex,IPI）等临床指标显著相关。也用自制的抗体检测了Carabin蛋白在B淋巴瘤样本中低表达，而在正常人的B细胞中高表达。因此，将P4HA2和Carabin视为B淋巴瘤的标记物。本专利技术的另一实施例中，通过实时荧光定量PCR（Real-timePCR,RT-PCR）的方法，用P4HA2特异引物，检测了15例急性髓性白血病和3例正常人血液抽提的外周血单个核细胞样本。本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测B淋巴瘤或白血病的标记物，其特征在于，一为P4HA2的基因、mRNA、cDNA或蛋白；二为Carabin的基因、mRNA、cDNA或蛋白；这里，P4HA2为脯氨酰‑4‑羟化酶二型α亚基，Carabin为TBC1结构域家族成员10C。

【技术特征摘要】
1.检测B淋巴瘤或白血病的标记物，其特征在于，一为P4HA2的基因、mRNA、cDNA或蛋白；二为Carabin的基因、mRNA、cDNA或蛋白；这里，P4HA2为脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基，Carabin为TBC1结构域家族成员10C。2.检测B淋巴瘤或白血病的试剂，其特征在于，包含：（a）P4HA2的抗体；（b）特异性扩增P4HA2的mRNA或cDNA的引物或引物对；（c）Carabin蛋白的抗体；这里，P4HA2为脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基，Carabin为TBC1结构域家族成员10C。3.检测B淋巴瘤或白血病的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：党永军，蒋维，李增霞，周晓燕，刘凯玉，崔照盟，谭仁可，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31