一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种聚酮合成酶基因，尤其涉及一种真菌黑色素合成相关的聚酮合成酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。一种聚酮合成酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的聚酮合成酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术所述聚酮合成酶基因可用于体外合成黑色素。经检测，体外酶反应液中黑色素含量为35.6g/L。

【技术实现步骤摘要】
一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)聚酮合成酶基因及其应用。
技术介绍
黑色素是生物体中广泛存在的保护性色素，具有生物半导体、清除自由基、防紫外线辐射、螯合重金属离子等功能，在日用化妆品工业、食品工业、医药工业、农业等众多领域有重要的用途。按照来源，黑色素可分为动物黑色素、植物黑色素和微生物黑色素；按照化学组成可分为真黑色素(eumelanin)、棕黑色素(phaeomelanin)和异黑色素(allomelanin)。真黑色素含碳、氢、氧、氮，不含硫原子，颜色为深棕色或黑色，主要存在于动物、家禽黑羽或蓝羽、眼、皮肤以及相关的组织中，是酪氨酸经由多巴(Dopa)途径转化聚合生成。棕黑色素含碳、氢、氧、氮、硫原子，颜色为略带红色的棕色和黄色，主要存在于家禽红棕色、浅黄色羽毛、头发和绒毛等组织中，合成途径与真黑色素接近，不同在于胱氨酸或谷胱甘肽参加了合成过程。异黑色素含碳、氢、氧，不含氮、硫原子，颜色为棕色或黑色，主要存在于植物和微生物中，是酚类物质在聚合酶和氧化酶作用下经聚合和氧化形成，研究表明植物和真菌中黑色素多数以二羟基萘(DHN)型黑色素为主要结构骨架。目前黑色素制备主要是从黑豆、黑芝麻等种皮和动物毛发、表皮分离提取，产量低、纯度低、成本高。随着人们对黑色素了解的不断加深，其功能研究与应用范围也日益广阔，使得人们对黑色素的需求量日益增加，仅靠有限的提取不能满足市场需求，迫切需要开发新的获得方法。黑酵母发酵提取与酶法体外合成黑色素具有周期短，能克服气候和产地限制，大大降低生产成本，因而受到广泛关注。聚酮合成酶(polyketidesynthase)是一类复杂的多酶体系，目前已发现的聚酮合成酶可大致分为3型，即I型模块型，II型迭代型，III型其他型。III型聚酮合成酶包括1,3,6,8-四羟基萘合成酶、查尔酮合成酶等。DHN型黑色素合成的第一步为聚酮合成酶中的1,3,6,8-四羟基萘合成酶催化丙二酰辅酶A合成1,3,6,8-四羟基萘，1,3,6,8-四羟基萘依次在小孢柱酮脱水酶(scytalonedehydratase)、羟萘还原酶(HNreductase)及多酚氧化酶(polyphenoloxidase)作用下合成DHN型黑色素。但聚酮合成酶基因与DHN黑色素合成相关的报道多集中于细菌中，真菌中有关聚酮合成酶基因与DHN黑色素合成的报道很少，出芽短梗霉在生物分类学上属于霉菌，为真菌的一种，目前很少有关于出芽短梗霉中DHN黑色素合成相关的聚酮合成酶的报道。而且国际上进行黑色素生产研究的聚酮合成酶较少，来源有限，因此，需要开发新的高效合成黑色素的酶源。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的一个目的是提供一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因。本专利技术提供的出芽短梗霉聚酮合成酶基因，为如下(1)或(2)的DNA分子：(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与SEQIDNO.1所示的DNA序列杂交且编码聚酮合成酶的DNA分子。上述聚酮合成酶基因来源于出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)3.3984(购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.3984)，基因全长为6492bp。本专利技术的另一目的是提供由上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因编码的聚酮合成酶。本专利技术提供的聚酮合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚酮合成酶活性的由序列1衍生的蛋白质。SEQIDNO.2所示的蛋白由2163个氨基酸残基组成。含有上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因的重组表达载体也属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述重组表达载体具体可为将上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因插入到pGAPZα-A表达载体的多克隆位点得到重组质粒。含有上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述重组菌可为将所述重组表达载体转化毕赤酵母SMD1168H得到的重组菌。本专利技术还提供上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因和/或聚酮合成酶在黑色素体外合成中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种黑色素体外合成的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：发酵培养所述重组菌，收集发酵上清液，沉淀上清液中的蛋白质，再对蛋白沉淀进行脱盐和浓缩，即得聚酮合成酶粗酶液；将聚酮合成酶粗酶液与出芽短梗霉粗酶液、丙二酰辅酶A混合，调节pH至8.0，38～40℃条件下反应，反应期间进行充分供氧，反应40～60分钟；反应结束后，调节pH至2.0～3.0，离心，收集沉淀，得到黑色素粗产物。所述出芽短梗霉粗酶液为出芽短梗霉新鲜菌体经液氮研磨破壁，50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重溶菌粉，4000rpm离心5分钟获得的上清液。由于DHN黑色素合成涉及到很多反应步骤，聚酮合成酶粗酶液催化合成1,3,6,8-四羟基萘是反应的第一步，而出芽短梗霉粗酶液包含DHN黑色素合成所需要的多种酶，通过加入出芽短梗霉粗酶液，目的是提供DHN黑色素后续合成所需要的酶，使1,3,6,8-四羟基萘转化为黑色素。本专利技术提供的方法，还包括：将黑色素粗产物进行纯化的步骤，具体如下：将黑色素粗产物溶于1mol/LNaOH中，加入2倍体积酸性甲醇(pH＝2)，静置4h，6000r/min离心10min后，收集沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤至中性，60℃烘干，即得黑色素。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术首次从出芽短梗霉中分离得到聚酮合成酶基因，该聚酮合成酶基因经克隆到pGAPZα-A表达载体上，转化毕赤酵母SMD1168H，获得聚酮合成酶，可用于黑色素体外合成，为黑色素体外合成提供了新的酶源和合成方法。(2)本专利技术还提供了一种体外合成黑色素的方法，通过发酵含有本专利技术聚酮合成酶基因的重组菌株，得聚酮合成酶粗酶液；再进一步与出芽短梗霉粗酶液、丙二酰辅酶A混合反应，并通过对反应条件的优化，大大提高了体外酶反应合成的黑色素的产量。(3)本专利技术的聚酮合成酶具有广泛的应用范围，可用于制药、化妆品、食品等领域。附图说明图1：本专利技术所述重组聚酮合成酶体外黑色素合成反应产物图；其中，反应前：重组聚酮合成酶粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，反应0分钟。对照组：含空载体pGAPZα-A的毕赤酵母SMD1168H发酵液粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，38℃反应60分钟；实验组：重组聚酮合成酶粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，38℃反应60分钟。具体实施方式下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法。实施例1：出芽短梗霉聚酮合成酶基因的PCR扩增将中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CMGCC)，菌种编号为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因，为如下(1)或(2)的DNA分子：(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交且编码聚酮合成酶的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因，为如下(1)或(2)的DNA分子：(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与SEQIDNO.1所示的DNA序列杂交且编码聚酮合成酶的DNA分子。2.由权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因编码的聚酮合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚酮合成酶活性的由序列1衍生的蛋白质。3.含有权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因的重组表达载体。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将权利要求1的出芽短梗霉聚酮合成酶基因插入到pGAPZα-A表达载体的多克隆位点得到重组质粒。5.含有权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘飞，张金华，王凤山，朱希强，于林艳，张林军，袁超，张祥奎，侯重文，凌沛学，
申请(专利权)人：山东大学，山东福瑞达医药集团公司，
类型：发明
国别省市：山东,37