本发明专利技术涉及由抗生链霉菌产生的治疗淋巴细胞白血病天然产物喷司他丁和抗孢疹病毒、水痘病毒天然产物阿糖腺苷的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。两个化合物的生物合成基因包含在同一个基因簇中且相互独立。整个基因簇共包含10个基因：3个与喷司他丁合成相关的基因；5个与阿糖腺苷合成相关的基因；2个与两者转运调节相关的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断或提高喷司他丁和阿糖腺苷的生物合成。本发明专利技术所提供的基因及其蛋白可用于该化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
【技术实现步骤摘要】
喷司他丁和阿糖腺苷生物合成基因簇及其应用
本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及核苷类抗生素喷司他丁(Pentostatin，PTN)和阿糖腺苷(arabinofuranosyladenine,Ara-A)的生物合成基因簇的克隆，序列分析，基因体内功能验证，体外生化研究及其应用。
技术介绍
1967年，科学家首次从抗生链霉菌NRRL3238(S.antibioticusNRRL3238)的发酵液中分离出嘌呤类核苷抗生素阿糖腺苷(Biochemistry,1972,11,911-916)。阿糖腺苷具有广泛的抗DNA病毒活性，并已经应用于单纯孢疹脑炎、新生儿孢疹、带状孢疹和慢性髓细胞性白血病的治疗中(Biochemistry,1972,11,911-916；TrendsPharmacolSci,2010,31,255-265)。由于阿糖腺苷极易于被细胞中广泛存在的腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase,ADA)作用转化形成阿糖肌苷(arabinofuransylhypoxanthine,Ara-I)，前期研究者同样从抗生链霉菌NRRL3238的发酵液中分离得到了腺苷脱氨酶的强有效抑制剂喷司他丁(pentastatin,PTN)。同样作为嘌呤类核苷抗生素，喷司他丁在临床上应用于急性T细胞型淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、皮肤T淋巴细胞瘤和多毛细胞白血病的治疗(JAntibiot(Tokyo),1992,45,1914-1918)。从化学结构上来看，阿糖腺苷作为腺苷的结构类似物，与腺苷在结构上的区别在于在C-2’位上的羟基发生立体异构；喷司他丁则含有一个特殊的1,3-二氮杂七元环。在前期报道中，通过同位素喂养实验，表明阿糖腺苷的生物合成途径中涉及到的C-2’的羟基异构化是由于C-2’和C-3’位的羟基发生交换而形成的(ArchBiochemBiophys,1989,270,374-382)。同样通过同位素标记实验，确定了喷司他丁的生物合成是以腺苷为前体，通过D-核糖的C-1插入嘌呤环的C-6位和N-1位形成了特殊的1,3-二氮杂七元环(Biochemistry,1984,23,904-907；Biochemistry,1987,26,5636-5641)；此外，也推测了喷司他丁生物合成的起始阶段与L-组氨酸的生物合成途径具有一定的相似性(Biochemistry,1988,27,5790-5795)。尽管阿糖腺苷和喷司他丁在临床上已得到广泛应用以及在化学合成方面的也有很好的研究进展，但是在过去数十年间，关于这两个嘌呤类核苷抗生素的生物合成仍然知之甚少。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术以一种抗生链霉菌(S.antibioticusNRRL3238)产生的具有抗DNA病毒的天然产物嘌呤类核苷抗生素喷司他丁和阿糖腺苷为目标分子，对其生物合成基因簇进行克隆，通过序列分析、功能验证、体外生化实验，揭示了一个基因簇包含两个独立的生物合成途径的现象。本专利技术中整个基因簇是包含10个基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1中第20237-28760位所示，其中负责喷司他丁生物合成的基因，即penA，penB，penC共3个基因；负责阿糖腺苷生物合成的基因，即penD，penG，penH，penI，penJ共5个基因；负责喷司他丁和阿糖腺苷转运和调控的基因penE，penF共2个基因。本专利技术还提供了一个编码ATP磷酸核糖转移酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2，命名为penA，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第26377-27285碱基处。本专利技术还提供了一个编码辅因子NADP(H)依赖的短链脱氢酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.3，命名为penB，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第25663-26367碱基处。本专利技术还提供了一个编码SAICAR合成酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.4，命名为penC，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第24933-25676碱基处。本专利技术还提供了一个编码SAH水解酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.5，命名为penD，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第23743-24933碱基处。本专利技术还提供了一个编码膜转运蛋白的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.6，命名为penE，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第22467-23672碱基处。本专利技术还提供了一个编码核苷磷酸化酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.7，命名为penF，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第21394-22470碱基处。本专利技术还提供了一个编码SAH水解酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.8，命名为penG，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第20237-21400碱基处。本专利技术还提供了一个编码氧化还原酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.9，命名为penH，其核苷序列位于SEQIDNO.1第28119-28760碱基处。本专利技术还提供了一个编码氧化还原酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.10，命名为penI，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第27743-28312碱基处。本专利技术还提供了一个编码氧化还原酶的核苷序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.11，命名为penJ，其核苷序列位于SEQIDNO.1中第27289-27774碱基处。从克隆生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物合成机制的研究揭示了一个基因簇包含两个独立的生物合成途径的现象，在这种独特的生物合成途径中蕴含了一个保护与被保护的机制，以及包括喷司他丁在内的独特化学结构形成的酶学机制。在此基础上运用代谢工程的原理，通过组合生物学对生物合成途径的合理修饰，探索结构稳定、活性更好、并能通过微生物大量发酵产生的新型药物。本专利技术的喷司他丁和阿糖腺苷生物合成基因簇的应用，包括(但不限于)：(1)本专利技术还提供了产生喷司他丁和阿糖腺苷生物合成基因簇中断的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有SEQIDNO.1中的核苷酸序列。(2)包含本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从抗生链霉菌NRRL3238(S.antibioticusNRRL3238)基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本专利技术中的部分序列。(3)包含本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。(4)包含本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。(5)本专利技术所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。(6)包含本专利技术所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗生素喷司他丁和阿糖腺苷的生物合成基因簇，其特征在于，所述的基因簇的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1中第20237‑28760位所示；基因簇所包括的编码喷司他丁和阿糖腺苷生物合成相关基因具体为：1)负责喷司他丁生物合成的基因，即
【技术特征摘要】
1.一种抗生素喷司他丁和阿糖腺苷的生物合成基因簇，其特征在于，所述的基因簇的核苷酸序列为SEQIDNO:1中第20237-28760位所示；基因簇所包括的编码喷司他丁和阿糖腺苷生物合成相关基因具体为：1)负责喷司他丁生物合成的基因，即penA，penB，penC共3个基因：penA位于SEQIDNO:1中第26377-27285位碱基处，长度为909个碱基对，编码ATP磷酸核糖转移酶，长度为302个氨基酸，氨基酸序列为SEQIDNO.2；penB位于SEQIDNO:1中第25663-26367位碱基处，长度为705个碱基对，编码短链脱氢酶，长度为234个氨基酸，氨基酸序列为SEQIDNO.3；penC位于SEQIDNO:1中第24933-25676位碱基处，长度为744个碱基对，编码SAICAR合成酶，长度为247个氨基酸，氨基酸序列为SEQIDNO.4；2)负责阿糖腺苷生物合成的基因，即penD，penG，penH，penI，penJ共5个基因：penD位于SEQIDNO:1中第23743-24933位碱基处，长度为1191个碱基对，编码SAH水解酶，长度为396个氨基酸，氨基酸序列为SEQIDNO.5；penG位于SEQIDNO:1中第20237-21400位碱基处，长度为1164个碱基对，编码SAH水解酶，长度为387个氨基酸，氨基酸序列为SEQIDNO.8；penH位于SEQIDNO:1中第28119-28760位碱基处，长度为642个碱基对，编码氧化还原酶，长度为213个氨基酸，氨基酸序列为SEQIDNO.9；penI位于SEQIDNO:1中第2...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈文青，巫攀，邓子新，万丹，徐顾丹，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。