小麦抗旱基因TaH2A.9及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种小麦抗旱基因TaH2A.9和含有所述基因的植物表达载体pSTART‑TaH2A.9及其在培育抗旱植物中的应用。实验证明，通过根瘤农杆菌介导的方法将本发明专利技术所述基因转入拟南芥或小麦，获得的转基因植株的抗旱能力明显提高，证实本发明专利技术的基因具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
小麦抗旱基因TaH2A.9及其应用
本专利技术属于生物基因工程
，尤其涉及一种小麦抗旱基因(基因TaH2A.9)及其应用。
技术介绍
干旱严重影响农作物产量，特别是随着工业的发展，干旱灾害愈来愈严重，而且土壤盐渍化也加剧了干旱灾害，使得干旱变成了一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而干旱灾害更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了加快科学灌溉系统建设、缓解土壤盐渍化以外，培育抗旱作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。利用转基因技术改良植物将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种并用于在旱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。目前，利用基因工程技术开展植物抗旱方面的研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于抗旱机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与抗旱相关的基因转入植物中，其转录和翻译产物可以使转基因植物的抗旱能力得到提高。检索表明已发现了一些能显著提高植物抗旱能力的基因，但有关H2A基因在植物抗旱过程中的作用报道较少。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种抗旱基因——小麦基因TaH2A.9及其应用。本专利技术的技术方案是：从小麦中分离得到基因TaH2A.9，然后将该基因转化到拟南芥中，进行转基因功能验证(拟南芥转化筛选及旱胁迫表性分析)，以实现研究H2A基因的功能以及抗旱机理。本专利技术所述的小麦抗旱基因，其特征在于：所述基因命名为小麦抗旱基因TaH2A.9，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供了一种含有上述小麦抗旱基因TaH2A.9的植物表达载体pSTART-TaH2A.9。本专利技术所述小麦抗旱基因TaH2A.9以及含有所述小麦抗旱基因TaH2A.9的植物表达载体pSTART-TaH2A.9在培育抗旱植物中的应用，其中，所述植物优选是普通小麦或拟南芥。本专利技术所述的小麦抗旱基因TaH2A.9以及含有所述小麦抗旱基因TaH2A.9的植物表达载体pSTART-TaH2A.9可广泛用于培育抗旱农作物品种。将本专利技术所述小麦抗旱基因TaH2A.9导入植物细胞，植物即可相应地获得抗旱能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaH2A.9的植物表达载体(pSTATR-TaH2A.9)进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。实际上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本专利技术优选的载体是pSTART。本专利技术的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本专利技术首次克隆得到了小麦抗旱基因TaH2A.9，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的抗旱能力明显提高，证实本专利技术的基因具有广泛的应用前景。附图说明图1：TaH2A.9基因全长cDNA序列的扩增结果其中：M为λDNA/(BamHI+SacI)Marker，下同；-：阴性对照。图2：NaCl胁迫下小麦中TaH2A.9的RT-PCR分析其中：Leaf表示叶；Root表示根；TaActin表示小麦Actin基因(内参)；数字表示胁迫时间(小时)。图3：pSTART-TaH2A.9拟南芥表达载体构建过程其中：A为带酶切位点的TaH2A.9片段扩增；B为XbaI和BamHI对pSTART-TaH2A.9载体进行双酶切条带；C为转化了pSTART-TaH2A.9大肠杆菌的菌体PCR验证；D为转化了pSTART-TaH2A.9农杆菌的菌体PCR验证。图4：拟南芥TaH2A.9转基因植株的基因组PCR和RT-PCR检测其中：V为空载体转基因株系；T1、T2为两个独立的转基因株系；C为野生型拟南芥；AtActin为拟南芥Actin基因内参；GenomicPCR为通过基因组PCR验证TaH2A.9整合到拟南芥基因组；RT-PCR为通过RT-PCR验证TaH2A.9在转基因株系中正常表达。数据显示，在转基因株系中能够扩增出TaH2A.9条带，而在空载体转基因株系及野生型中不能扩增出条带，表明TaH2A.9整合到拟南芥基因组中并且正常表达。图5：干旱胁迫下转基因植株的生长状况其中：WT为未转化拟南芥植株；T1/T2为两个独立的转基因株系；VC为空载体对照。数据表明，转化TaH2A.9的转基因拟南芥的抗旱能力明显增加。具体实施方式实施例1、TaH2A.9的克隆和表达分析1.1提取小麦TotalRNA1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；4.4℃，12000rpm离心15分钟；5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min或过夜；6.4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；7.RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤；4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；8.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；10.紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μlRNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kbDNAMarker作为对照。1.2cDNA反转录反转录酶：M-MLVReverseTranscriptase(Invitrogen)。1.12μl反应体系2.65℃变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:5×First-StrandBuffer4μl0.1MDTT2μlRNaseOUT(Invitrogen)1μl3.轻轻混匀，37℃反应2min；4.加入1μlM-MLVRT，混匀，37℃反应50min；5.70℃温育15min使M-MLVRT失活；6.加入1μlRNaseH(Invitrogen)，37℃反应20min；7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。1.3开放阅读框的克隆和序列测定1.引物序列：根据测序结果，设计基因上下游引物，扩增基因的开放阅读框。2.PCR反应体系(50μl)：3.PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。4.扩增片段回收后与pMD-18T载体连接并转化大肠杆菌DH10B，测序由上海Invirtron公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦抗旱基因，其特征在于：所述基因命名为小麦抗旱基因TaH2A.9，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种小麦抗旱基因，其特征在于：所述基因命名为小麦抗旱基因TaH2A.9，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种含有权利要求1所述小麦抗旱基因TaH2A.9的植物表达载体pSTART-TaH2A.9...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勐骋，吕宏君，李永超，夏光敏，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37