基于毛细管电泳和SSR标记的高通量麦芽纯度鉴定技术制造技术

本发明专利技术提供了一种SSR引物组，包括3对SSR引物，分别为HVM68、Bmag0007和EBmac755。本发明专利技术还提供了一种利用该SSR引物组进行高通量麦芽纯度鉴定的方法，包括以下几个步骤：提取供试品种样品的DNA、用不同荧光染料标记的SSR引物进行多重PCR扩增、毛细管电泳荧光检测和数据分析。通过3对SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，可以构建麦芽品种指纹数据库。本发明专利技术建立了毛细管电泳技术与SSR荧光标记相结合的高通量麦芽纯度鉴定方法，结果稳定可靠，检测效率提高，能够在短时间内对大量样品进行快速测定，可作为商业仲裁的判定依据，杜绝麦芽掺假和售假行为的出现，从源头上保障啤酒生产企业的产品质量。

【技术实现步骤摘要】
基于毛细管电泳和SSR标记的高通量麦芽纯度鉴定技术
本专利技术创造属于生物
，具体涉及一种麦芽纯度鉴定的方法，尤其涉及一种基于毛细管电泳和SSR标记的高通量麦芽纯度鉴定的方法。
技术介绍
啤酒是以麦芽、酒花、水为主要原料，经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。麦芽作为啤酒的主要原料，是大麦经浸麦、发芽、干燥和焙焦等工艺制得的，麦芽的质量直接决定啤酒的质量。与其他麦芽指标相比，麦芽纯度鉴定也是评价麦芽质量的重要指标。中国的啤酒产量多年来稳居世界第一，但国产大麦产量不足，需要大量从海外进口，主要来自加拿大、澳大利亚和法国。进口大麦和国产大麦之间存在较大的价格差，因此个别麦芽生产企业将廉价麦芽掺入进口大麦生产的麦芽中，以次充好，从中牟利。此外，某些麦芽生产企业也通过混合不同品种麦芽来调配麦芽指标，以此满足啤酒企业严格的麦芽采购标准。混合后的麦芽尽管指标靓丽，但麦芽均一性变差，容易引起糖化、过滤、发酵等一系列问题，进而给啤酒企业带来一系列的经济损失。啤酒企业由于缺乏麦芽纯度鉴定的技术手段，即使明知对方掺假也无计可施，只能吃哑巴亏。因此麦芽纯度鉴定不仅是评价麦芽质量的重要指标，也是保证麦芽一致性和啤酒生产一致性的前提，但是目前尚无快速高效的麦芽纯度鉴定方法。近年来以微卫星(SSR)分子标记为基础的大麦、小麦等主要农作物的DNA指纹库构建已逐步开展，基于聚丙烯酰胺凝胶电泳技术在大麦遗传多样性及纯度鉴定等方面的研究也有相关报道。聚丙烯酰胺凝胶电泳属于SSR分子标记最常用的方法，通过比较目的条带的位置进行样品品种的判断，但该法不能准确读出片段大小，只能粗略估计。且该法操作繁琐，在样品数量和SSR位点较多时检测工作费时费力。麦芽纯度鉴定时要求取100粒麦芽进行分析，根据检测出的杂粒数来计算样品纯度。如果使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对100粒麦芽进行多SSR位点的纯度鉴定，由于不能准确读出片段大小而影响结果的准确性，而且检测周期较长，无法满足商业采购对结果快速判定的要求。假设使用10对引物进行麦芽品种鉴定，则100粒麦芽需要进行1000次PCR反应，1000次聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，检测周期至少需要4周，根本无法满足商业麦芽采购的要求。因此聚丙烯酰胺凝胶电泳法仅适用于几粒麦芽样品的品种鉴定分析，无法满足麦芽纯度鉴定时100粒麦芽的检测要求。毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，毛细管电泳具有高灵敏度、高分辨率、快速、自动化、样品少、应用范围广等优点。毛细管电泳检测的样品中均含有分子量内标，DNA片段直接与其泳道中的分子量内标相比就可精确获得其大小数值，而聚丙烯酰胺凝胶电泳所得片段大小只能用肉眼与DNAMarker做比较后估测得出，特别是远离Marker的条带在判定时容易产生误差。专利技术专利申请ZL201410090899.0提供了一种“利用SSR标记与毛细管电泳鉴定甘蔗杂交种子纯度的方法”。该申请是利用SSR标记与毛细管电泳技术相结合，具体方法包括提取甘蔗基因组DNA，选取多态性较高的SSR引物，对甘蔗DNA进行多重PCR扩增，利用毛细管凝胶电泳检测PCR产物，对SSR标记数据进行分析，计算杂交组合F1的杂交率。SSR-毛细管凝胶电泳技术能精确给出片段大小，分离效率高，结果稳定可靠，能够有效的鉴定出杂交种子纯度。但目前还未见基于毛细管电泳技术和SSR分子标记对麦芽纯度进行高通量鉴定的相关报道。
技术实现思路
针对现有麦芽纯度鉴定所存在的上述问题，本专利技术提供了SSR引物组以及利用该引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法。本专利技术的技术方案是：本专利技术利用SSR分子标记与毛细管电泳技术相结合对17个品种的麦芽进行纯度鉴定，筛选出适合鉴定麦芽纯度的SSR荧光引物。SSR引物组，包括3对SSR引物，分别为HVM68、Bmag0007和EBmac755；所述3对SSR引物序列如下：利用上述三对SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，包括以下步骤：(1)提取供试品种样品的DNA：从麦芽样品中随机数取96粒麦芽，采用CTAB法提取供试样品的DNA。取单粒麦芽样品于1.5ml离心管中，约25-45mg，加入7-8mm钢珠，利用ThmorganCK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加入65℃预热的CTAB提取缓冲液600ul，涡旋混匀裂解样品。由于麦芽中富含蛋白质、多糖、多酚等物质，分离难度大，因此添加4ulβ-巯基乙醇和1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，防止多酚氧化褐变和DNA降解，有效去除多酚和多糖。65℃水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋剧烈混匀20s，使成乳状液。室温下，10000rpm离心10分钟，吸取300μl的上清液到新离心管中，加10μl的RNaseA放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体积的异丙醇，直至白色线状DNA形成块状沉淀。-20℃条件下放置20分钟以上，10000rpm离心3分钟收集沉淀。加650μl的70％乙醇冲洗液，轻摇几分钟，10000rpm离心2min，弃滤液。打开盖，平放于洁净场所，使乙醇挥发。加适量TE缓冲液溶解DNA，2-8℃保存DNA。(2)用3种荧光染料标记的3对SSR引物进行多重PCR扩增：用3种荧光染料标记的3对SSR引物分别对供试样品模板DNA进行多重PCR扩增，3对SSR引物的5’端分别标记AlexaFluor750、AlexaFluor680、AlexaFluor647的荧光染料。PCR扩增采用20μL的反应体积，含MgCl22.5mmol/L，dNTP0.20mmol/L，正向荧光引物、反向引物各0.03-0.05μmol/L，TaqDNA聚合酶0.7单位，2×PCR缓冲液(不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。(3)毛细管电泳荧光检测：a、制备SLS/DSS混合液：取0.5μl的DSS-400分子量内标，加入39.5μl的SLS甲酰胺上样缓冲液，在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；b、样品孔中加入1μl稀释后的PCR产物，加一滴石蜡油覆盖样品；c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；d、将上样板和缓冲板放入BECKMANGeXP遗传分析系统仪(BECKMAN公司，美国)中，进样电压2.0kV，时间30sec；90℃变性120sec；分离电压6.0kV，时间50min。在毛细管凝胶电泳过程中，PCR产物与DSS-400分子量内标的荧光信号均由基因分析仪自动保存。毛细管电泳四色荧光检测法是将毛细管电泳与四色荧光检测技术相结合。该方法采用三对引物多重PCR扩增SSR位点，三对引物在5’端标记三种不同颜色的荧光染料，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小。运用四色荧光检测系统使通过一次毛细管电泳能同时检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
SSR引物组，其特征在于：包括3对SSR引物，分别为HVM68、Bmag0007和EBmac755；所述3对SSR引物序列如下：

【技术特征摘要】
1.SSR引物组，其特征在于：包括3对SSR引物，分别为HVM68、Bmag0007和EBmac755；所述3对SSR引物序列如下：。2.利用权利要求1所述的SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取供试品种样品的DNA；(2)用不同荧光染料标记的SSR引物进行多重PCR扩增；(3)毛细管电泳荧光检测；(4)数据分析。3.根据权利要求2所述的利用SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，其特征在于：所述麦芽包括以下17种麦芽：。4.根据权利要求3所述的利用SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增的反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。5.根据权利要求3所述的利用SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，其特征在于：所述PCR扩增体系采用20μL的反应体积，包括2.5mmol/L的MgCl2、0.20mmol/L的dNTP以及正向荧光引物、反向引物各0.03-0.05μmol/L，TaqDNA聚合酶0.7单位，2×PCR缓冲液(不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。6.根据权利要求3所述的利用SSR引物组对麦芽纯度进行高通...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹花，张志军，岳杰，余俊红，王书谦，房莉，周月南，祁明霞，纪秀苹，
申请(专利权)人：青岛啤酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37