一种黑曲霉的复合诱变方法技术

本发明专利技术公开了一种黑曲霉的复合诱变方法，该方法包括如下步骤：(1)孢子预培养；(2)菌体酶解脱壁；(3)常压室温等离子体诱变；(4)原生质体再生培养；(5)24孔板筛选；(6)摇瓶发酵复筛。本发明专利技术方法中脱去细胞壁后的原生质体，没有细胞壁的阻挡，诱变剂更容易进入细胞核内，可以快速地作用于遗传物质，遗传物质发生变异的概率更大、效率更高，诱变效果会更明显。

【技术实现步骤摘要】
一种黑曲霉的复合诱变方法
本专利技术涉及微生物菌种的诱变选育
，尤其是涉及一种一种原生质体与常压室温等离子体诱变复合选育黑曲霉柠檬酸高产菌株的方法。
技术介绍
柠檬酸具有广阔的应用前景和市场需求。出于经济层面考虑，一部分研究在现有菌种的基础上利用价格更低廉的粗糖原料以及农业废渣来生产柠檬酸，而另一部分研究则致力于改良菌种。生产菌种的改造和选育是柠檬酸发酵工业的基础，决定了发酵过程的成败和发酵产品工业化生产的价值。我国是柠檬酸生产大国，虽然柠檬酸转化率已经接近理论水平，产量可以达到170g/L，但发酵周期偏长，工业生产发酵周期普遍为72h，工业发酵水平还有待提高。目前，国内的黑曲霉生产菌株均由诱变育种获得，常用的诱变方法为化学诱变(硫酸二乙酯、亚硝基胍和氯化锂等)和物理诱变(紫外、60Co等)。化学诱变剂主要通过与碱基结合形成加合物以及造成DNA烷基化引入变异，紫外则通过使DNA分子形成环丁烷嘧啶二聚体阻碍碱基间的正常配对造成核酸变异。这些诱变操作存在安全性风险，此外诱变效率可控性有限。常压室温等离子体诱变是最近发展起来的技术，电子在射频电场作用下获得能量，通过碰撞，与周围中性粒子发生能量交换，使其分解、激发或电离，在两级电压作用下，气体被击穿产生放电，形成具有一定电离度的等离子体。通过高浓度的中性活性粒子会造成细胞的亚致死效应，使核酸出现开环、断裂、破碎现像，再利用细胞自身的DNA修复机制，实现胞内遗传物质的变化。此外，等离子体产生的活性氧成分(reactiveoxygenspecies，ROS)由于细胞膜通透性增强而进入细胞，也进一步造成DNA损伤。因此等离子诱变可以同时造成基因突变和染色体变异,有望获得高产黑曲霉柠檬酸生产菌株。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种黑曲霉的复合诱变方法。本专利技术方法使用设备简单、操作方便、诱变效率高。本专利技术的技术方案如下：一种黑曲霉的复合诱变方法，所述方法为在黑曲霉原生质体上进行常压室温等离子体诱变，具体包括如下步骤：(1)孢子预培养；(2)菌体酶解脱壁；(3)常压室温等离子体诱变；(4)原生质体再生培养；(5)24孔板筛选；(6)摇瓶发酵复筛。所述步骤(1)中孢子预培养的方法为：从活化培养好的斜面收集孢子(将-80℃冻存的黑曲霉甘油管种转接到斜面培养基进行活化培养，34-37℃培养6天，活化2次)，并以106个/mL的接种量接种到装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培养16h，然后收集菌球。所述斜面培养基配方：麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L，琼脂1.5％，121℃灭菌15min。所述步骤(2)的具体方法为：将菌球用KMC液洗涤2～3次后过滤，然后加入50mL溶壁酶和几丁质酶溶液，混匀，置于37℃水浴保温处理2h后，4℃2000g离心10min，弃上清液，用KMC液洗涤2次除去细胞壁酶解液，将原生质体悬浮于100μLKMC液中备用。所述KMC液：0.7MKCl，50mMCaCl2，20mMMes/NaOH，pH5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用；所述细胞壁酶解液：5mg/mL溶壁酶、0.2U/mL几丁质酶，0.22μM无菌过滤器除菌。所述步骤(3)的具体方法为：将原生质体悬液吸取10μL置于载片上，常压室温等离子体诱变处理120s，工作条件为：气体流量10slm，照射功率100W。所述步骤(4)的具体方法为：将原生质体用KMC液系列梯度10-105倍，吸取100μL原生质体稀释液于再生固体培养基中进行再生培养，培养条件35℃培养36h。所述原生质体再生培养基配方：麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L，1.2M山梨醇，1％的琼脂，121℃灭菌15min。所述步骤(5)中24孔板筛选的方法为：将在原生质体再生培养基上生长起来的单菌落待长出浓密孢子，用24孔板进行初筛；具体步骤包括：①种子培养：每个孔装3mL种子培养基，接种1个菌株，35℃，180rpm培养24h；所述种子培养基为玉米清液和混液按比例混合，总糖含量10％，总氮含量0.2％；②发酵培养：每个孔装3mL发酵培养基，接种量300μL，35℃，180rpm培养60h；所述发酵培养基：玉米清液和混液按比例混合，总糖含量15％，总氮含量0.08％，121℃灭菌15min；③筛选：通过检测每个孔道的柠檬酸产量来筛选高产菌株进行保藏。所述步骤(6)摇瓶发酵复筛经过种子培养和发酵培养两个过程，其中种子培养为：250mL三角瓶装50mL种子培养基，温度35℃，250rpm，培养24h；发酵培养为250mL三角瓶装50mL发酵液，种子接种量为10％，温度35℃，转速250rpm，培养72h。所述方法还包括步骤(7)传代稳定性检测，即：将孢子制备含15％甘油的冻存管，冻存于-80℃，活化培养并以此为第一代；从第一代斜面种刮取孢子液，稀释后涂布于固体培养基35℃培养24h至长出单菌落，将单菌落转接到新的斜面培养，此为第二代；从第二代斜面刮取孢子液，稀释后涂布于固体培养基35℃培养24h至长出单菌落，将单菌落转接到新的斜面培养，此为第三代；以此类推，传至第20代，将20代菌株进行摇瓶发酵试验，并检测发酵液柠檬酸产率。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术方法中脱去细胞壁后的原生质体，没有细胞壁的阻挡，诱变剂更容易进入细胞核内，可以快速地作用于遗传物质，遗传物质发生变异的概率更大、效率更高，诱变效果会更明显；本专利技术方法中常压室温等离子体诱变技术设备简单、操作方便、不需要真空条件，等离子体射流温度低且活性粒子分布均匀，对环境及人没有危害；本专利技术方法可获得柠檬酸产率大幅提高的诱变菌株，具有较好的遗传稳定性，柠檬酸产量从120g/L提高到140g/L，效果显著。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术进行具体描述。实施例一种黑曲霉的复合诱变方法，所述方法为在黑曲霉原生质体上进行常压室温等离子体诱变，具体包括如下步骤：(1)孢子预培养，将-80℃冻存的黑曲霉甘油管种转接到斜面培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L，琼脂1.5％，121℃灭菌15min)进行活化培养，37℃培养6天，活化2次后，刮取孢子；刮取的孢子以106个/mL的接种量接种到装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培养16h，然后收集菌球；(2)菌体酶解脱壁：取菌球用KMC液洗涤3次后，然后加入50mL溶壁酶和几丁质酶溶液(5mg/mL溶壁酶、0.2U/mL几丁质酶，0.22μM无菌过滤器除菌)，混匀，置于37℃水浴保温处理2h后，2000g离心10min，弃上清液，用高渗KMC液洗涤2次除去溶壁酶，将原生质体悬浮于100μLKMC液(0.7MKCl，50mMCaCl2，20mMMes/NaOH，pH5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用)中备用；(3)常压室温等离子体诱变：将原生质体悬液用吸取10μL置于载片上，常压室温等离子体诱变(气体流量10slm，照射功率100W)处理120s；(4)原生质体再生培养：取诱变后和未经诱变(对照)的原生质体用KMC液梯度稀释10～105倍，吸取0.1mL原生质体稀释液于再生固体培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L，1.2M山本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑曲霉的复合诱变方法，其特征在于所述方法为在黑曲霉原生质体上进行常压室温等离子体诱变，具体包括如下步骤：(1)孢子预培养；(2)菌体酶解脱壁；(3)常压室温等离子体诱变；(4)原生质体再生培养；(5)24孔板筛选；(6)摇瓶发酵复筛。

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉的复合诱变方法，其特征在于所述方法为在黑曲霉原生质体上进行常压室温等离子体诱变，具体包括如下步骤：(1)孢子预培养；(2)菌体酶解脱壁；(3)常压室温等离子体诱变；(4)原生质体再生培养；(5)24孔板筛选；(6)摇瓶发酵复筛。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中孢子预培养的方法为：从活化培养好的斜面收集孢子，并以106个/mL的接种量接种到装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培养16h，然后收集菌球。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的具体方法为：将菌球用KMC液洗涤2～3次后过滤，然后加入50mL溶壁酶和几丁质酶溶液，混匀，置于37℃水浴保温处理2h后，4℃2000g离心10min，弃上清液，用KMC液洗涤2次除去细胞壁酶解液，将原生质体悬浮于100μLKMC液中备用。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)的具体方法为：将原生质体悬液吸取10μL置于载片上，常压室温等离子体诱...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭艳红，胡志杰，蒋小东，孙福新，金赛，邵玉芬，李江华，刘龙，
申请(专利权)人：江苏国信协联能源有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32