本发明专利技术公开了一种可以表达HIV‑1入侵抑制剂ECLD或ESCLD而抑制HIV‑1感染的重组腺相关病毒，涉及基因工程和抗病毒技术。本发明专利技术利用携带有入侵抑制剂基因ECLD或ESCLD的重组腺相关病毒转导入侵抑制剂ECLD和ESCLD基因进入真核细胞，表达该入侵抑制剂，通过抑制剂有效抑制HIV‑1的感染。本发明专利技术利用腺相关病毒包装入侵抑制剂，结合了二者各自的优势，真核表达该抑制剂，提供了一种新型的对抗HIV‑1病毒感染的方法，对开发治疗/预防HIV‑1的方法方面有重要价值。
【技术实现步骤摘要】
一种可以表达HIV-1入侵抑制剂ECLD而抑制HIV-1感染的重组腺相关病毒
本专利技术涉及基因工程和抗病毒感染技术，尤其涉及一种可以表达HIV-1入侵抑制剂ECLD或ESCLD的重组腺相关病毒。具体地说，本专利技术利用该重组腺相关病毒感染细胞表达入侵抑制剂融合蛋白ECLD、ESCLD，靶向人CD4+T淋巴细胞表面的HIV-1主要受体CD4，从而抑制HIV-1病毒感染。
技术介绍
1981年，美国CDC(CentersforDiseaseControl)第一次报导了获得性免疫缺陷综合征，即AIDS；1983年，法国科学家首次分离到了人类免疫缺陷病毒1型(humanimmunodeficiencyvirus-1，HIV-1)，并确认它是导致获得性免疫缺陷综合征的病原。到目前为止，全球约有7800万人感染艾滋病病毒，并有3900万人死于艾滋病病毒感染及其引发的并发症。截止2013年末，仍约有3500万人携带艾滋病病毒。鉴于HIV-1严峻的流行形势，在过去的35年间，针对HIV-1开展了大量的研究。但是到目前为止仍然未有有效的预防性疫苗或治愈性手段的面世，而在众多治愈手段中，最为重要的成果就是鸡尾酒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)。持续性的鸡尾酒疗法，使得HIV-1感染者体内的病毒载量长期维持在一个低水平，大幅度延长了艾滋病患者的寿命，使其生活质量大幅提高但是鸡尾酒疗法也有其不能忽视的弊端，由于联合用药导致其高昂的费用，长期服药对肝肾的负担加重，以及HIV-1变异导致的抗药性都使得鸡尾酒疗法并不是对抗HIV-1的长远之计。而在预防性疫苗的研究中，尽管不断提出新的思路以及方向，但仍未能找到一种对大多数人群具有高保护性的疫苗。疫苗上的挫折，使得越来越多的研究聚焦于其余方面，其中，入侵/感染抑制剂的研究显得尤为突出。HIV-1入侵细胞是HIV-1感染的第一步，而HIV-1的入侵细胞过程非常复杂，造成了HIV-1对入侵过程中的变化比较敏感，入侵过程中任何条件的变化都有可能会造成HIV-1入侵细胞失败，因此也创造了很多可以靶向的位点或者蛋白来抑制HIV-1的入侵。腺相关病毒(Adenovirus-associatedVirus，AAV)载体系统能够转导目标基因进入细胞并得到长期稳定的表达。所述腺相关病毒载体来源于腺相关病毒。腺相关病毒(adenovirus-associatedvirus，AAV)是一种属于细小病毒科的非致病性的病毒，病毒结构为正二十面体，直径大约为20nm。到目前为止已经分离有100多种血清型。腺相关病毒最主要的特点是必须在辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)的参与下才能进行复制。腺相关病毒是单链DNA病毒，其野生型的基因组全长约为4.7kb，两端具有反向末端重复序列(ITRs)调控其基因组上rep，cap两个基因的表达。Rep表达4个蛋白，对AAV的复制，转录，整合以及包装非常重要。Cap则表达3个AAV的结构蛋白。其入侵细胞之后，少部分整合在人类19号染色体的一个特定位点上(AAVS)，大多数形成类染色体。腺相关病毒的ITRs序列包含了其复制和包装所必须的元件。因此，将编码病毒基因的野生型基因组替换为各种靶标基因，借用其入侵细胞和整合到染色体上的功能将靶标基因转导入细胞，这就是腺相关病毒载体的由来。将AAV载体与入侵抑制剂结合起来，如果能够在体内持续性地表达一种高效的入侵抑制剂，可以在一定程度上规避对传统疫苗的需要。另外，现在所采用的高效抗逆转录病毒疗法采用的多为一种逆转录酶抑制剂，一种整合酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂的结合体，而HIV的高突变性带来的耐药性使得药物在使用上捉襟见肘，因此，急需开发新的药物。而入侵抑制剂作为一个新兴的方面，还尚未有很好的药物面世，开发新的高效的入侵抑制剂可以使得抗逆转录病毒疗法的选择更为多样，减少耐药毒株的出现。基于以上背景，本实验室前期研发并构建了入侵抑制剂融合蛋白CLD(由sCD4分子和sDC-SIGN分子联合而成)(专利文献CN102617738A)，并通过原核表达纯化得到蛋白，在细胞、原代细胞以及黏膜组织上验证了其同时具备抑制HIV-1感染和传播的生物学功能。原核CLD展现出优良的抗病毒活性，但是原核表达系统表达的融合蛋白CLD与CLD源于人的两个功能结构域存在区别：原核生物缺乏蛋白质翻译后修饰。同时，蛋白的表达、纯化也会大大增加使用的成本。为了促进CLD的实用化，需要进一步建议建立一种能够在真核细胞中持续表达CLD的表达系统，并验证其对HIV-1的抑制情况。因此本专利技术在CLD的基础上进行改造，并设计了一种可以真核表达CLD的系统，得到ECLD和ESCLD，该系统以及蛋白还可以用于开发抗HIV-1感染的药物的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以表达HIV-1入侵抑制剂ECLD或ESCLD的重组腺相关病毒及其载体以及该病毒的制备方法；该病毒感染细胞之后，细胞表达入侵抑制剂ECLD或ESCLD从而抑制HIV-1感染。本专利技术目的是这样实现的：采用已有的腺相关病毒载体系统，构建一种新的重组腺相关病毒。该病毒能够转导经过改造的入侵抑制剂ESCLD或ECLD基因进入细胞，真核表达该蛋白，利用表达的抑制剂ECLD或ESCLD抑制HIV-1病毒入侵和感染。所述融合蛋白ECLD或ESCLD是一种入侵抑制剂，该融合蛋白的构成为一个可溶性的CD4分子(其D1和D2区，也即是CD4分子的功能区，sCD4)与DC-SIGN的Neck结构域和CRD结构域(去掉DC-SIGN的胞内域)的sDC-SIGN，两个蛋白之间由3-9个重复的G4S(4个甘氨酸和一个丝氨酸)相连，并在此基础上进行了改造，得到了现有的蛋白序列，如SEQIDNO.1至SEQIDNO.7所示，并构建了能够让其在真核细胞内表达的系统。通过重组腺相关病毒转导融合蛋白ECLD或ESCLD的基因进入细胞，表达得到的融合蛋白ECLD或ESCLD相比于原核表达系统表达的CLD，在蛋白二级结构和高级结构的层级上均不一样，而真核表达的ECLD或ESCLD，其抑制效果更好。ECLD或ESCLD对不同病毒的IC50值比CLD对不同病毒的IC50值可以低3-5倍，如图7；而相比现在已知的一些效果较好的广谱性中和抗体，ECLD或ESCLD的IC50值也有明显下降，其降低的倍数可以达到10-1000倍，如图8。因此，真核表达的ESCLD或ECLD相比原核表达的CLD具有显著的进步。更为甚者，原核表达系统表达的CLD对HIV-1早期病毒株的抑制效果不佳，但是真核表达系统表达的ECLD或ESCLD对HIV-1早期病毒株具有良好的抑制效果，如图5。而早期病毒株是在HIV-1初始感染中的决定性因子，对这些毒株的中和能力在很大程度上决定了其抑制HIV-1病毒传播的能力，更能反应其抑制HIV-1的能力，而现有技术中存在的抑制剂和抗体对HIV-1早期病毒株的抑制效果和广谱性均不甚良好，尤其是不能得到一种广谱性和抑制效果都有显著提高的抑制剂。而通过重组腺相关病毒转导的ECLD或ESCLD相比之前存在的抑制剂和抗体，尤其是相比原核表达的CLD，其抑制HIV-1早期病毒株的广谱性和抑制效果都有显著提高，取得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组腺相关病毒，其特征在于：感染细胞之后，使得细胞表达入侵抑制剂融合蛋白ECLD，其序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示氨基酸序列中的任意一个。
【技术特征摘要】
1.一种重组腺相关病毒，其特征在于：感染细胞之后，使得细胞表达入侵抑制剂融合蛋白ECLD，其序列为SEQIDNO.1至SEQIDNO.7所示氨基酸序列中的任意一个。2.一种重组腺相关病毒，其特征在于：感染细胞之后，使得细胞表达并分泌入侵抑制剂融合蛋白ESCLD至胞外，其所述ESCLD为权利要求1所述ECLD蛋白N端添加分泌型信号肽形成。3.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于：具有能够表达入侵抑制剂融合蛋白ECLD的核酸序列，该序列为SEQIDNO.8至SEQIDNO.14所示的核酸序列中的任意一个。4.权利要求3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：表达载体骨架为改造而来的腺相关病毒Helper-free系统的pAAV-IRES-hrGFP载体或者pAAV-MCS。5.权利要求3或4所述的重组腺相关病毒载体，其特征还在于：在所述ECLD的核酸序列起始密码子之后添加有一段信号肽的核酸序列。6.权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征还在于：其所述信号肽为HIV-1CN54包膜糖蛋白的信号肽。7.权利要求1或2所述的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于：①表达入侵抑制剂融合蛋白ECLD和ESCLD的腺相关病毒载体构建设计与构建入侵抑制剂融合蛋白ECLD和ESCLD，随后对腺相关病毒系统的载体质粒进行改造，并将ECLD和ESCLD元件克隆至载体质粒中；②腺相关病毒的包装与验证将腺相关病毒载体系统转染至HEK293细胞，转染66-72小时之后，收集细胞，反复冻融4次释放病毒，并通过10000转/分钟的速度离心十分钟收集含有病毒粒子的上清，...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡勤学，邓旭，杜涛，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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