抑制子宫颈癌的融合蛋白制造技术

本发明专利技术是有关于一种抑制子宫颈癌的融合蛋白，包括：一段人类乳突状病毒１６型Ｅ７蛋白胜太片段；一段具有移位功能的胜太片段；以及一段具羧基终端部分的胜太片段；本发明专利技术还揭示一种与Ｅ７胜太结合的抗体组成物，其中该Ｅ７胜太序列为ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种融合蛋白，尤指一种用于抑制子宫颈癌的融合蛋白。
技术介绍
在台湾，子宫颈癌发生率一向高居妇女癌症首位。一般子宫颈上皮变异或是早期子宫颈癌发生时，几乎没有任何症状，虽然早期治疗愈后效果良好，但预防胜于治疗，因此相关学者皆以找寻能有效预防子宫颈癌的方法为目的。目前已证实人类乳突病毒(human papillomavirus，HPV)与子宫颈癌的形成息息相关，是子宫颈癌最主要的致病因子。HPV的某些亚型(如16、18型)的DNA序列已在75％～100％的子宫颈癌病例的癌细胞中发现，但其致癌机制尚未完全清楚。近来发现HPV的16、18和31高危险亚型的早期病毒基因产物E6和E7蛋白，极易与Rb和p53基因的产物结合并中和其抑制细胞生长的功能，这现象说明了HPV在致癌时不是单独作用的，同时也需要环境因素的协同；且E7蛋白在子宫颈癌细胞和癌组织细胞内持续表现，并在维持转化组织恶性表型的过程中扮演着重要的角色。肿瘤免疫反应以细胞免疫为主，体液免疫为辅。参加细胞免疫的反应细胞主要有细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)、自然杀手细胞(NK)和巨噬细胞。CTL被细胞介白素2(IL-2)启动后，藉由可被T细胞识别，位于抗原呈现状态的肿瘤细胞上的组织兼容性复合体(majorhistocompatibility compolex，MHC)第一型分子的出现，而释放某些溶解酶，将肿瘤细胞杀灭，并抑制肿瘤细胞的增殖。CTL的保护作用在对抗如HPV导致的肿瘤时特别明显，因此，如能通过增加HPV抗原与MHCI型分子的复合体出现于肿瘤细胞的途径来诱发属于具备HPV抗原特异性的CTL如CD8+T细胞的增殖，则有可能直接针对抑制肿瘤细胞来进行免疫预防或治疗。已有研究证实子宫颈癌可通过施打疫苗来事先预防，而由于与形成子宫颈癌息息相关的HPV病毒结构中，E7蛋白常被发现于癌症病灶组织或是癌化前损伤的组织，因此具有做为疫苗发展标的的潜力；此外，目前发展中的DNA疫苗虽然具有长效特性，但是其高成本，高危险性(病毒本身容易被诱发突变)的考量仍是限制其发展的主因；然而，在应用E7蛋白做为子宫颈癌的基因治疗时，常由于HPV病毒E7蛋白的弱抗原特性，而无法诱发良好的免疫反应，进而无法发生所预期的预防或治疗的功效。一般而言，肿瘤的特异性抗原必须在宿主体内经过处理后与MHC-I型分子结合，才能被呈现到细胞表面以启动CD8+T淋巴细胞。有研究显示子宫颈癌组织中含有HPV16 E7基因，但缺乏能够呈现出E7基因编码抗原特定的MHC-I型分子的特定复合体于抗原呈现细胞表面，使得HPV16 E7蛋白在宿主体内不被呈现而逃过宿主的免疫监视。此外，一般做为疫苗的蛋白质在进入生体中时，多会被细胞认为是外源抗原，而在还没发挥作用的前即分解，而减低了蛋白质疫苗的效果，因此必须发展一种传输系统可以有效的将蛋白质抗原完整送达细胞质内部，同时又能诱发生体产生有效性细胞免疫反应的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可针对特定癌症诱发细胞免疫效果的融合蛋白，尤其是不易诱发免疫反应的弱抗原病毒，本专利技术可由有效传输系统以及激发细胞免疫的过程达到抑制癌化细胞增殖的目的，而降低癌化程度甚至达到预防癌症的功效。本专利技术融合蛋白可于接受融合蛋白的生体细胞中诱生CTL及抗体的保护作用，进而促使被感染的细胞由于抗原的呈现而被歼灭；本专利技术亦提供一种含有抑制子宫颈癌融合蛋白的医药组合物，以期于细胞发生癌变的前抑制癌化细胞增殖，达到抑制癌症发生的目的。本专利技术提供的抑制子宫颈癌的融合蛋白，T细胞疫苗或含该融合蛋白的医药组合物，包括一段人类乳突状病毒16型(human papillomavirus，HPV，type 16)的E7蛋白胜太片段；一段具有移位功能的胜太片段；以及一段具羧基终端部分的胜太片段。于本专利技术融合蛋白中，其中人类乳突状病毒16型的E7蛋白胜太片段的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1；适用的移位胜太片段可选自常用的任何一种具移位功能的胜太片段，较佳是来自假单胞菌属外毒素(pseudomonasaeruginosa exotoxin A)的一部分；而羧基终端部分的胜太片段亦可选自常用的任何一种具羧基终端的序列，较佳来自假单胞菌属外毒素的一部分，且，该羧基终端部分的胜太片段包括KDEL的胺基酸序列，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.2。本专利技术较佳的融合蛋白胺基酸序列为SEQ.ID.NO.3。本专利技术还提供一种与E7胜太结合的抗体组成物，其中该E7胜太序列为SEQ.ID.NO.1；利用本专利技术抗体组成物，可侦测生体内E7胜太片段的出现，并以抗原抗体方式键结的。本专利技术利用细菌性毒素的特性，使带有蛋白质的细菌毒素与标的细胞(抗原呈现细胞)的细胞膜表面接受器接合，使蛋白质进入细胞，并发挥细菌毒素自然的位移特性，再将蛋白质带至细胞质；此时，位于细胞质的外源蛋白质可被产制成小胜太，并接着与组织兼容性复合体II或I型分子(MhcII or MhcI)进行结合，而被呈现于抗原呈现细胞的外部，与MhcII或I结合者再由CD4+T或CD8+T细胞辨识，而诱发一连串的免疫反应，使本专利技术融合蛋白达到免疫提升的功效。本专利技术的医药组合物可包括根据技艺中已知的技术使用适合的佐剂；分散剂或保湿剂(如Tween80)以及悬浮剂调配无菌注射剂，例如，无菌注射水溶液或含油性悬浮液。无菌注射制剂亦可用于无毒性注射的稀释剂或溶剂中的无菌注射液或悬浮液，例如，于1，3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受的载体与溶剂中，有甘露醇、水、Ringer溶液、与等张氯化钠溶液。此外，常用的使用灭菌、固定油类作为溶剂或悬浮介质(例如合成的单酸或二酸甘油酯类)。脂肪酸(例如油酸与其甘油酯衍生物)，以及天然医药上可接受的油类(例如橄榄油或蓖麻油，尤其是其多氧乙基化的型态)，可使用于可注射制剂。此等油溶液或悬浮液亦可含有长链醇稀释剂或分散剂、或羧甲基纤维素或类似的分散剂。其它一般使用的界面活性剂例如Tweens或Spans或其它类似的乳化剂或生体可用率增强剂(一般用于制造医药上可接受的固体、液体、或其它剂量形式)亦可用于调配的目的。口服投药用的组合物可为任何口服上可接受的剂量形式，包含但不限于胶囊、锭、乳剂、及水性悬浮液、分散剂、与溶液。在口服用途的锭剂的例中，一般使用的载体包含乳醣及玉米淀粉。一般亦常添加润滑剂，例如，硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服投药而言，可使用的稀释剂包含乳糖及玉米淀粉。当口服投药水性分散剂或乳剂时，可使活性成份与乳化剂或悬浮剂组合悬浮或分散于油相中。若需要，可添加特定的甜味剂、风味剂、或着色剂。鼻腔喷剂或吸入剂组合物可依据医药配方的技艺中习知的技术制备，及可制成生理食盐水，使用苯甲醇或其它适合的防腐剂、增加生体可用率的吸收促进剂、氟碳化合物、及/或其它技艺中已知的溶解剂或分散剂。含吲哚化合物的组合物亦可以直肠投药的栓剂形式投药。医药组合物中的载体必须为″可接受″，意为与配方中的活性成份相容(及较佳地是能使配方安定)及对接受治疗的病患无害。其它载体的实例包含胶态二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠、及D&C黄色10号。附图说明图1为本专利技术实施例二质体构筑的流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制子宫颈癌的融合蛋白，包括：一段人类乳突状病毒１６型（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ，ｔｙｐｅ１６）的Ｅ７蛋白胜太片段；一段具有移位功能的胜太片段；以及一段具羧基终端部分的胜太片段。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：章修纲，廖朝暐，郑文芳，
申请(专利权)人：生宝生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]