冠状病毒特异性T-细胞抗原决定簇制造技术

本发明专利技术涉及一组与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒的Ｂ－细胞抗原决定簇。本发明专利技术还涉及上述冠状病毒（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）Ｔ－细胞抗原决定簇作为一种新的免疫治疗药物、疫苗或者治疗性疫苗抗原，用于开发和研制预防和／或治疗重症急性呼吸道综合征的药物和疫苗的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一组与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)的T-细胞抗原决定簇谱，以及所述抗原决定簇作为潜在的免疫治疗药物、疫苗或者治疗性疫苗抗原，可用于研究开发用于预防或治疗与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒感染的药物和疫苗的用途。
技术介绍
与人类相关的冠状病毒(Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus(SARS-CoV))已经被确认为新的一类病毒，人类以迄今最快的速度测定了其基因序列，主要由RNA-依赖性RNA聚合酶、刺突(S)、膜(M)、被膜(E)、核壳(N)、聚合酶(P)等蛋白组成(1、MarraMA等人，SARS相关冠状病毒的基因组序列，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月1日；2、Rota PA等人，与重症急性呼吸道综合征相关的新冠状病毒的表征，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月1日；3、Qin E’de，等人，SARS相关病毒的完整序列和比较分析(Isolate BJ01)，Chinese ScienceBulletin 2003，48(10)941-948；4、Peoros JS，等人，重症急性呼吸道综合征的可能病因-冠状病毒，The Lancet，www.nejm.org，2003年4月8日；5、Ksiazek TG等人，与重症急性呼吸道综合征相关的新冠状病毒，N Engl J Med，2003，348(20)1953～1966；6、Dorsten C等人，重症急性呼吸道综合征患者中新冠状病毒的鉴定，N Engl J Med，www.nejm.org，2003年4月10日；Anand K等人，冠状病毒主要蛋白酶(3CLpro)结构设计抗SARS药物的基础，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月13日)。其中刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白和被膜(E)蛋白组成了病毒外壳，是病毒识别、结合并进入宿主细胞的蛋白质。尤其是刺突S蛋白是关键性蛋白(图1)。虽然文献研究结果表明HCoV-229E刺突S蛋白的417-546序列是宿主受体结合的部位，但同时也指出不同的冠状病毒通过使用不同的受体进入宿主细胞。这很可能与刺突S蛋白的变异有关(Marra MA等人，出处同前)。核壳(N)蛋白属于胞浆内蛋白，处于病毒颗粒的核心部分，和基因组RNA以结合的形式存在。病毒RNA在细胞质中复制完成后会和N蛋白结合，结合产物可以被M蛋白识别并被包装到病毒颗粒中。所以N和M蛋白与病毒在宿主细胞中的复制具有明显的关系。N蛋白是宿主T-细胞识别的主要位点之一(见图1)。因而，发展合成病毒蛋白的多肽化合物化学库，对于寻找病毒表面蛋白的多重最小多肽抗原决定簇(包括B-细胞和T-细胞抗原决定簇)，进而寻求和发展合成多肽疫苗、临床诊断试剂和血清治疗方案有极其重要的意义。同时，该化学库还可用于筛选并发现病毒结合受体的多重配基，进而阻断冠状病毒进入宿主细胞，发展治疗药物(特别是对于耐药病毒的药物治疗)有极大的参考价值。目前，寻找抗原决定簇最为常用的方法是利用各种计算机软件，通过已经发表的序列采用亲水性、疏水性、转角结构、HPLC滞留系数、螺旋结构、保守性等参数进行预测。我们的实验结果表明，这种预测方法与实际测得的序列仅有30％～50％的重复性(1、ZHANG XM，LIU G和SUN MJ，Brain Research，2000，868157-164；2、ZHANGXM，LIU G和SUN MJ，Brain Research，2001，895277-282.)。另一种方法是采用组合化学技术对蛋白抗原决定簇谱的研究(“交叉重叠”多肽化合物)组合化学把化学合成、计算机设计选结为一体，能同时产生许多种结构相关但有序变化的化合物，并采用高度灵敏和高通量的生物学方法对这些化合物同时进行筛选，从中确定具有生物活性的物质，或者全新的先导化合物的技术。因而，本技术涉及了许多种类的“似药”分子，如小分子杂环化合物、天然产物、生物寡聚体及其模拟物等。本专利技术是在前述专利(一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段，申请号200310101892.6。)所组合合成的SARS-CoV“交叉重叠”生物寡聚体多肽化学库基础上完成的。该法的特点是以一定数目的氨基酸残基肽(比如1到50个氨基酸残基)为合成“交叉重叠”片段，将蛋白序列通过逐个错位(或者间隔错位，包括从2到合成肽片段的氨基酸的总位数)的方式全部合成出来，然后进行多肽与抗体、受体、酶、或者细胞等反应，进而有可能发现抗原决定簇、配基、酶的底物或者抑制和激活剂、以及诱导细胞产生细胞因子等。本专利技术人采用固相合成技术、射频编码技术短时间内合成了大量的“交叉重叠”多肽化合物，在首次合成与SARS-CoV相关的S、M、E和N蛋白的全部“交叉重叠”多肽的基础上，通过采用ELISPOT实验技术从在先专利申请(200310101892.6)中所得的“交叉重叠”多肽化学库中分四步筛选得到了如下的特异性T-细胞抗原决定簇，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的一个方面，涉及一组冠状病毒SARS-CoV的T-细胞抗原决定簇，其选自至少一种下列多肽序列，或其任一组合，包括T-1KKISNCVADY(S343-352)(SEQ ID NO1)T-2VADYSVLYNS(S349-358)(SEQ ID NO2)T-3DQLTPAWRI(S613-621)(SEQ ID NO3)T-4IIRGHLRMAG(M143-152)(SEQ ID NO4)T-5IPIGAGICAS(S650-659)(SEQ ID NO5)T-6MAGHSLGRCD(M150-159)(SEQ ID NO6)T-7TALALLLLDR(N218-227)(SEQ ID NO7)T-8TVTKKSAAEA(N246-255)(SEQ ID NO8)本专利技术的完成是在化学合成了冠状病毒(SARS-CoV)结构蛋白“交叉重叠”肽库的基础上完成的。具体的，本专利技术首先通过采用物理编码法依据现有技术中公开的相关信息，合成了“交叉重叠”多肽化学库。在此基础上，通过采用ELISPOT实验技术从“交叉重叠”多肽化学库中分四步筛选得到了上述的特异性T-细胞抗原决定簇步骤一将肽库中单一多肽化合物顺序按照每10个多肽(25微克/孔)为一组进行混合，并与含一定细胞数的新鲜分离得到的外周血单核细胞(3×105细胞/孔，从SARS康复患者采取血样中分离得到)在37℃下共孵育24小时，阴性和阳性对照分别为(0.1％DMSO)和(Con A 8.0μg/孔)，再加入生物基化的检测抗体，并显色。IFN-γ-释放细胞数由Bio-Reader 4000(Bio-Sys Inc.德国)读取。本实验中以新鲜分离的正常人外周血单核细胞做对照。步骤二将第一轮发现的活性孔内多肽分别分配到10个检测板孔内，进行第二次ELISOPT实验(重复第一步)，从而确定单一多肽化合物。代表性结果见图3。步骤三将单一多肽与一定量的非特异性性免疫调节剂MDP-C(参见在先申请专利，申请号200本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒的Ｔ－细胞抗原决定簇，其选自至少一种下列多肽序列，或其任一组合，包括：Ｔ－１：ＫＫＩＳＮＣＶＡＤＹ（Ｓ３４３－３５２）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）Ｔ－２：ＶＡＤＹＳＶＬＹ ＮＳ（Ｓ３４９－３５８）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）Ｔ－３：ＤＱＬＴＰＡＷＲＩ（Ｓ６１３－６２１）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）Ｔ－４：ＩＩＲＧＨＬＲＭＡＧ（Ｍ１４３－１５２）（ＳＥＱＩＤＮＯ： ４）Ｔ－５：ＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳ（Ｓ６５０－６５９）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）Ｔ－６：ＭＡＧＨＳＬＧＲＣＤ（Ｍ１５０－１５９）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）Ｔ－７：ＴＡＬＡＬＬＬＬＤＲ（Ｎ ２１８－２２７）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）Ｔ－８：ＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡ（Ｎ２４６－２５５）（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，程桂芳，李莉，杨红振，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]