本发明专利技术属于制药工程领域，是一种治疗白血病的［１３１］↑Ｉ标记ＧＭ－ＣＳＦ蛋白质的制备方法。本发明专利技术采用化学合成法将治疗髓性白血病的放射性同位素［１３１］↑Ｉ标记粒单系集落刺激因子ＧＭ－ＣＳＦ，制备［１３１］↑Ｉ－ＧＭ－ＣＳＦ时ＧＭ－ＣＳＦ的反应浓度为０．１ｇ／Ｌ－１０ｇ／Ｌ，［１３１］↑Ｉ放射性活度为１ｍＣｉ／Ｌ－４００ｍＣｉ／Ｌ。本发明专利技术动物实验结果表明，［１３１］↑Ｉ－ＧＭ－ＣＳＦ具有组织特异性杀伤作用。用本发明专利技术方法制备的蛋白质对治疗急性髓性细胞白血病有毒副作用小，避免在人体内产生人抗鼠抗体，可以多次重复使用，并且有成本低的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于制药工程领域，特别涉及一种利用GM-CSF与其细胞表面受体的结合作为白血病靶向治疗的131I标记GM-CSF蛋白质的制备方法。
技术介绍
白血病是危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤。急性髓性系白血病(acute myeloid leukemia，AML)起病急，病死率高，虽然近十几年干细胞移植在AML的应用使一半的患者获得长期生存，但仍有约50％的患者因为难治或复发而死亡。白血病细胞多药耐药(MDR)和微量残留白血病是难治和复发的主要原因。目前采用结合化疗药物或生物毒素的单克隆抗体以增强肿瘤杀伤力、克服白血病细胞多药耐药和消灭微量残留白血病的作用，已开始临床治疗试验。但是这些方法有以下局限性①每一个肿瘤细胞都需表达靶抗原。②溶酶体的内化作用使药物降解。③许多肿瘤细胞具有多药耐药性。④体内产生抗毒素抗体。⑤剂量限制性毛细血管渗漏综合征。因此单克隆抗体有制作复杂，仅对单一的表面抗原起靶向作用、抗原抗体结合的解离常数较大的缺点。在肿瘤的治疗中放射免疫治疗即用单克隆抗体结合放射性同位素进行治疗(radioimmunotherapy，RIT)具有两点优势①核衰变释放的射线能杀灭邻近的肿瘤细胞无论它是否表达靶抗原。②克服了肿瘤细胞的多药耐药性(参见文南Frankel AE，Sievers EL，Scheinberg DA.Cell surface receptor-targetedtherapy of acute myeloid leukemia.Cancer Biother Radiopharm，2000，15(5)459-476.)。与传统的分次、短时、高剂量外照射放疗相比，RIT为持续性较低剂量内放射治疗，核素半衰期不同持续数天到数周，避免肿瘤细胞在放疗间隔期DNA的修复。虽然RIT比传统放疗剂量小，但是白血病和淋巴瘤细胞与实体瘤细胞不同它们受放射率的影响很小。且还存在一种放射率反向效应，即受到持续低剂量辐射的细胞被阻止在细胞周期G2期，G2/M期的细胞对射线最敏感，因此细胞聚集在该阶段也就增加了放射性细胞毒作用。此外，RIT对肿瘤细胞具有相对的特异性杀伤作用，减少了对正常组织的损害(参见文献Oliver W.Press.Physics for practitionersthe use of radiolabeled monoclonalantibodies in B-cell Non-Hodgkin’s lymphoma.Semin Hematol，2000，37(suppl 7)2-8.)目前国外用于AML放射免疫治疗(RIT)的制剂是131I标记的抗CD33和抗CD45鼠型单克隆抗体，对难治性和复发性的AML有较好反应。对微小残留白血病及骨髓移植前的预处理也是一种有效的治疗手段。但单抗价高，且在人体内鼠型抗体致人抗鼠抗体产生，不能多次重复使用，因此，疗效受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的，是提供一种治疗白血病的131I标记GM-CSF蛋白质的制备方法。所述蛋白质采用GM-CSF作为新的载体携带131I治疗AML，保证RIT制剂的组织特异性杀伤力和抗AML耐药性，避免在人体内产生人抗鼠抗体，可以多次重复使用，并且成本低。采用本专利技术方法可以制备治疗白血病的放射性同位素标记GM-CSF蛋白质。其方法是采用同位素交换法或化学合成法或生物合成法，将治疗髓性白血病的放射性同位素标记粒单系集落刺激因子GM-CSF蛋白质，放射性同位素包括67Cu、125I、131I、90Y、186Re、188Re、212Bi、211At。优选地，采用化学合成法中的氯胺-T法或乳过氧化物酶法(LPO)或固相氧化法或联胺标记法将131I标记GM-CSF蛋白质。更优选地，采用氯胺-T法合成131I-GM-CSF。具体方法见实施例1。制备131I-GM-CSF的放射性同位素I131的放射性活度为1mCi/L-400mCi/L，GM-CSF的反应浓度为0.1g/L-10g/L。本专利技术的最佳技术方案是制备131I-GM-CSF的GM-CSF剂量为100-300μg(0.5g/L-0.9g/L)，131I放射性活度为4-8mCi(10mCi/L-40mCi/L)。在所述条件下，反应总体积较小，标记率较高，可以获得高放射性浓度的产品，并且有效保证了131I-GMCSF的免疫活性。本专利技术采用急性髓性白血病细胞株HL60，该细胞缺失p53，高表达bcl-2和bcl-xl，结合位点为322个/细胞。本专利技术的有益效果是1.利用GM-CSF与其细胞表面受体的结合作为白血病靶向治疗的一种新的载体，在急性髓性细胞白血病的治疗中，通过GM-CSF与含有该受体的白血病细胞结合把放射性131I带入相应的位置，利用I131所放射的β粒子的细胞毒性作用杀灭瘤细胞。这种细胞毒性作用可贯穿多层细胞，对靶细胞和邻近细胞都能发挥效应，属于低剂量、近距离放射性同位素的治疗(内放射治疗)。采用131I标记的GM-CSF治疗急性早幼粒细胞白血病小鼠模型，测定131I-GM-CSF在体内的分布、对白血病的靶向治疗效果、毒副作用的产生。2.131I是一种易于标记、且标记后对抗体生物学特性影响较小的放射性核素，它的物理半衰期为8.04天，有效半衰期为7.6天，合适的半衰期使得131I有足够的时间浓聚于病灶和保证有相当数量的放射性核素在病灶部位衰变，而且它发射的射线有较高的传能线密度(LET)且在生物组织内射程较短，因此使用I131可获得更高的疗效并能减少毒副作用。3.131I-GM-CSF下调p53、上调bc1-2和bcl-xl，通过线粒体途径诱导HL60细胞凋亡，具有抗髓性白血病细胞的作用。4.由于GM-CSF能促进细胞进入增殖周期，增加细胞对射线的敏感性，因此131I-GMCSF诱导凋亡的作用大于131I。5.由于131I-GM-CSF能明显降低HL60细胞bcl-2和bcl-xl的表达，其可以通过抑制凋亡克服MDR(细胞多药耐药)，131I-GM-CSF与化疗药物有协同作用。6.动物试验131I-GM-CSF在骨髓和瘤肿块的放射性浓度最高，在其他正常组织中放射性浓度低，说明131I-GM-CSF具有组织特异性杀伤作用。7.白血病动物模型试验结果131I-GM-CSF治疗组生存期较对照组明显延长，从动物试验水平进一步说明131I-GM-CSF具有抗髓性白血病细胞的作用。附图说明图1为HL-60细胞凋亡相关基因的表达；图2为急性早幼粒细胞白血病小鼠生存曲线；图3为131I-GM-CSF在急性早幼粒细胞白血病小鼠中生物学分布(用药后30分钟)图4为131I-GM-CSF在急性早幼粒细胞白血病小鼠中生物学分布(用药后4小时)具体实施方式为了进一步说明用131I标记GM-CSF蛋白质的制备方法，参照下列实施例说明，这些实施例是为了进一步进行解释，而不以任何方式限制本专利技术。本实施例是I131标记GM-CSF蛋白质的制备方法，并且采用该蛋白质凋亡HL60细胞的动物实验和结果。材料 1.131I由重医附一院核医学科提供，GM-CSF(健白，由北京北医联合医药有限公司提供)。氯胺-T、交联葡聚糖G-50购自北京邦定生物医学公司。胎牛血清购自杭州四季青工程有限公司。牛血清白蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种治疗白血病的［１３１］↑Ｉ标记ＧＭ－ＣＳＦ蛋白质的制备方法，其特征在于：采用化学合成法将治疗髓性白血病的放射性同位素标记粒单系集落刺激因子，放射性同位素为［１３１］↑Ｉ，粒单系集落刺激因子为ＧＭ－ＣＳＦ，制备［１３１］↑Ｉ－ＧＭ－ＣＳＦ时ＧＭ－ＣＳＦ的反应浓度为０．１ｇ／Ｌ－１０ｇ／Ｌ，［１３１］↑Ｉ放射性活度为１ｍＣｉ／Ｌ－４００ｍＣｉ／Ｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：娄世锋，周慷，陈林，邓扬嘉，徐诣芝，张萍，陈姝，邓建川，罗云，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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