一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用。本发明专利技术公开了一种抗菌三肽，其序列为Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ，具有抗绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌的效果。经过化学修饰的抗菌三肽也具有抗嗜水气单胞菌、绿脓杆菌、溶藻弧菌等的效果。这将为抗生素开发提供新的先导化合物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体的说涉及一种抗菌三肽及其化学修饰产物与应用。
技术介绍
抗生素指由细菌、霉菌或其它微生物在代谢过程中产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质，是人类20世纪最伟大的发现之一。自1940年以来，青霉素开始应用于临床，不计其数的人从中受益。然而，耐药性问题也随之而产生，在使用第一代青霉素时细菌就已经出现耐药性。迄今为止，不存在对抗生素完全敏感的细菌。在国际上享有“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”美誉的万古霉素，已经发现了相应的耐药细菌而面临着失效的危险。有关调查显示，大肠杆菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性已高达70％，幽门螺旋杆菌的耐药率则升至82％。截至上世纪末，全世界每年死于细菌性感染的人数已达到2000万，这是40年前的3倍。耐药性病原体增多特别是多重耐药性病原体的增多使人类面临耐药菌感染的威胁。如果不解决抗生素的耐药性问题，终有一天将会导致人类本身对所有抗生素药品都有耐药性，而“无药可用”。解决耐药性问题的有效方法是开发新药，其他解决方法包括老药新用与改进现有制剂，合理用药，探索新的抗菌治疗方法，抗菌疫苗的开发与应用等等。研究表明许多生物的基因组中也有编码抗生素的基因。这些基因编码的多为一些短肽，称为抗菌肽。抗菌肽一般携带正电荷，其具有抗菌活性强、不易产生耐药性等特点。但抗菌肽一般长为10到40个氨基酸，具有一定的免疫原性与较差的生物可及性。一般生物可及性好的药物分子量都在数百道尔顿。如果能够发现小分子抗菌寡肽，则能够开发新的抗生素的资源。所以，抗菌寡肽的分离具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对细菌普遍对抗生素有耐药性的问题，提供一种能够抑制细菌生长的抗菌三肽。本专利技术的另一个目的是提供上述抗菌三肽的化学修饰物。本专利技术的另一个目的是提供上述抗菌三肽及其化学修饰物在制备抗菌药物中的应用。本专利技术的抗菌三肽，其DNA序列为CACGAATTA，氨基酸序列为His Glu Leu。本专利技术的抗菌三肽可以采用基因工程的方法生产，也可以采用化学合成法合成。通过对该抗菌三肽进行化学修饰，其化学修饰物同样具有很好的抗菌效果。例如，本专利技术通过对该抗菌三肽进行α-氨基端乙酰化，得到其化学修饰物Ac-His GluLeu。对其进行羧基端酰氨化，得到另一种化学修饰物His Glu Leu-NH2。本专利技术中抗菌三肽His Glu Leu的分离是通过以下技术措施实现的构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达；插入用EcoR I和Xba I双酶切的含有诱导型启动子的酿酒酵母载体；为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，用核酸外切酶III和绿豆芽核酸酶对其进行消化处理；纯化后电激转化酿酒酵母；转化子转接至半乳糖诱导表达平板，过夜生长后用含细菌菌种的上层培养基覆盖，观测抑菌圈；用液体培养基诱导表达后测抑菌率；对阳性克隆进行PCR扩增，测序；化学合成部分抗菌肽，用琼脂糖扩散法检测活性。本专利技术的抗菌三肽及其化学修饰物具有很好的抗菌效果，可以用于开发新的抗生素。本专利技术的抗菌三肽及其化学修饰物能够抑制绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌等等细菌的生长。抗菌三肽His Glu Leu及其化学修饰物His GluLeu-NH2能够很好的抑制绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、多杀巴斯德杆菌的生长；化学修饰物Ac-His Glu Leu能够很好的抑制绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌的生长。本专利技术的有益效果本专利技术的抗菌三肽及其化学修饰物具有分子量小、生物可及性好的优点，同时不具高的免疫原性，可以作为抗生素开发的先导化合物。绿脓杆菌是比较严重的感染原，现在急需开发新的药物。而本专利技术的抗菌三肽及其化学修饰物具有抗绿脓杆菌的效果。另外，由于本专利技术的三肽对水产养殖常见菌具有抗菌效果，因此能够在水产业得到应用。附图说明图1为琼脂糖覆盖实验图；图1a为阳性转化子对上层的绿脓杆菌形成抑菌圈结果图；图1b为空载体转化子对上层的绿脓杆菌抑制效果图；图2为全自动合成的、纯度为99.3％的抗菌三肽His Glu Leu(HL3)、纯度为98.5％的抗菌三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、纯度为99.1％的抗菌三肽His GluLeu-NH2(HL3NH2)点样100μg在含嗜水气单胞菌的培养基所形成的抑菌圈结果图；图3为全自动合成的、纯度为99.3％的抗菌三肽His Glu Leu(HL3)点样100μg在含绿脓杆菌的培养基所形成的抑菌圈结果图；图4分别为全自动合成的、纯度为98.5％的抗菌三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、纯度为99.1％的抗菌三肽His Glu Leu-NH2(HL3NH2)点样100μg在含绿脓杆菌的培养基所形成的抑菌圈结果图；图5分别为全自动合成的、纯度为99.3％的抗菌三肽His Glu Leu(HL3)、纯度为98.5％的抗菌三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、纯度为99.1％的抗菌三肽His GluLeu-NH2(HL3NH2)点样100μg在含溶藻弧菌的培养基所形成的抑菌圈；图6分别为全自动合成的、纯度为99.3％的抗菌三肽His Glu Leu(HL3)、纯度为98.5％的抗菌三肽Ac-His Glu Leu(ACHL3)、纯度为99.1％的抗菌三肽His GluLeu-NH2(HL3NH2)点样100μg在含多杀巴斯德杆菌的培养基所形成的抑菌圈；其中，在图2中，上部为0.1μl 50mg/ml庆大霉素的正对照；在图4中，上部为0.1μl 100mg/ml庆大霉素的正对照；在图5中，上部为0.1μl 50mg/ml庆大霉素的正对照；在图6中，上部为0.1μl 100mg/ml氨苄青霉素的正对照。具体实施例方式实施例1(1)构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达。两个引物分别为<1>GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA。<2>CGTCTAGATCA(N)9TCTTTTCTCGAGAGAT。用具有高保真活性的PfuDNA聚合酶扩增。扩增模板使用量为每1ml PCR反应液50ng质粒pPICZαA(Invitrogen产品，含酵母α交配因子前导肽DNA序列)。扩增条件为94℃ 5分钟预变性；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 20秒，25个循环；72℃ 5分钟补平。扩增产物用1/10 2.5M NaAc，pH5.2和2.5倍无水乙醇于13000rpm沉淀7分钟。用70％乙醇洗涤，13000rpm沉淀3分钟。电吹风吹干。悬浮在无菌蒸馏水里。用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。(2)5μg pYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。取6.5μl双酶切的pYES2/CT，加入6μl双酶切的PCR产物，1.5μl 10X连接酶缓冲液，1μl T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。(3)为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，需用核酸酶对其进行消化处理。连接产物用Qiag本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌三肽，其ＤＮＡ序列为ＣＡＣＧＡＡＴＴＡ，氨基酸序列为ＨｉｓＧｌｕＬｅｕ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秋云，何建国，崔亮，曹燕，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]