一种抗邻苯二甲酸二丙酯抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗邻苯二甲酸二丙酯抗体，其特征在于：它是由式（Ⅰ）表示的邻苯二甲酸二丙酯人工全抗原作为免疫原，通过常规方法得到的。还公开了上述抗体的制备方法，包括如下步骤：以哺育动物或禽类动物作为免疫反应器，用已纯化的邻苯二甲酸二丙酯免疫原和完全佐剂充分乳化后，进行初次免疫注射，然后再以不完全佐剂进行追加强化反应，待５０～１００天后兔等哺育动物血清或鸡等禽类蛋黄中即含有抗邻苯二甲酸二丙酯抗体，将血清或蛋黄收集，纯化抗体，冻干保存。本发明专利技术抗体实用性强、稳定性好、制备技术简便可行：整个制备过程无需特别的仪器设备，成本低廉，容易工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗体及其制造方法，特别涉及一种水体和饮用水中环境激素邻苯二甲酸二丙酯免疫检测的抗体及其制备方法。
技术介绍
自从1996年3月，美国副总艾尔·戈尔作序，美国学者西奥·科尔伯恩(TheoColborn)博士等著的《Our Stolen Future》一书中首先提出环境激素(Environmental endocrine disruptors)及其对环境的影响以来，有关环境内分泌干扰物质种类及其对人类健康的危害及作用机制等问题已引起学术界和公众的极大关注，也引起了发达国家政府、WHO等机构的高度重视。环境激素，即指会使人类及生物的内分泌系统发生紊乱的外来物质，其具有类似雌激素的作用，主要随人类生产和生活排放到环境中。野外调查和实验研究表明，环境激素类物质能导致生物与人体的性激素分泌量及活性下降、精子数量减少、生殖器官异常、癌症等发病率增加，并使生殖能力降低，后代的健康与成活率下降等。环境激素污染使生物与人类的持续生存和繁衍受到威胁并严重地威胁着全球环境。在世界野生动物基金会(World Wild Animal Foundation，WWF)1997年列出的68种环境激素中，邻苯二甲酸酯类(Phthalic Acid Esters，PAEs，也叫酞酸酯)环境激素占有8种，是其中主要的一大类。邻苯二甲酸二丙酯也被列入其中。邻苯二甲酸二丙酯主要作为增塑剂大量用于塑料、橡胶以及化妆品、香料、印染、涂料等行业。我国是塑料制品的生产、消费大国，“白色污染”也很普遍。但是，塑料污染的危害在过去长期未被人们重视。近来研究发现，该类环境激素物质可以通过饮食、呼吸和皮肤透过等途径被人体吸收，主要危害人体的靶器官是雄性生殖系统。随着塑料制品的使用规模不断扩大，邻苯二甲酸酯类环境激素造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应，日益受到人们的关注和担忧。环境荷尔蒙物质常以ppt浓度甚至ppq浓度存在，这对环境监测分析提出了更高的要求，日本、美国已经实施，我国正在起步阶段。超微量环境监测技术的开发和研究是摆在我国环境科学工作者面前的重要任务之一。目前对邻苯二甲酸类环境激素的监测主要气相色谱、液相色谱和气液联用等色谱技术，但由于色谱技术本身的限制，测定前必须进行衍生化，使得试样的前处理十分复杂，操作繁琐，所用的仪器昂贵，要求有熟练的操作人员和较长的分析周期，方法的灵敏度也受到限制，难以适应对环境激素的检测和监测要求。因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能测定邻苯二甲酸酯类环境激素污染物，以实现在野外和实验室内进行大批量的筛选实验，为污染的现状调查与分析、毒理性研究、预测发展趋势、检验污染治理效果等提供有力保障。免疫分析方法以其特异性和高灵敏的化学发光、荧光等技术结合建立相应的荧光免疫和化学发光免疫等方法可以满足此项要求。1958年Berson S.A和Yellow创立了放射免疫分析(RIA)，其标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。后来逐渐发展的酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光免疫分析、化学发光免疫分析等已在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。但由于人们对邻苯二甲酸酯类环境激素的危害认识较晚，免疫分析方法应用于邻苯二甲酸酯类环境激素的监测研究也起步较晚。第一个邻苯二甲酸酯类环境激素免疫分析的报道是1993年Ius A.等人制备的抗邻苯二甲酸二甲酯抗体，通过抗原抗体反应证明了邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁苄酯及邻苯二甲酸二辛酯总量测定的可能性。2000年Goda Y等人提出了用ELISA测定邻苯二甲酸酯总量的方法。2002年美国专利US 6,399,318公开了制备邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁苄酯及邻苯二甲酸环己二酯等抗原、抗体的方法和ELISA测定邻苯二甲酸二乙酯的方法。但文献没有涉及邻苯二甲酸二丙酯的半抗原衍生物、全抗原及免疫分析的报道。本专利技术通过制备的邻苯二甲酸二丙酯人工抗原免疫动物可制备出特异性强、效价高的抗邻苯二甲酸二丙酯抗体。并提供容易而方便的制备方法。参考文献(1)Ius A，Bacigalupo MA，Meroni G，Pistillo A，Roda A.Development ofa time-resolved fluoroimmunoassay for phthalate esters in water.Fresenius’J Anal Chem.1993，345，589-591. (2)Goda Y，Kobayashi A，Fukuda K，Fujimoto S，Ike M，Fujita M.Development of the ELISA for detection of hormone-disruptingchemicals.Water SciTechnol.2000，42(7-8)，81-88. (3)Estevez-Alberola M.-C.；Marco M.-P.Immunochemical determination ofxenobiotics with endocrine disrupting effects.Anal BioanalChem.2004，378563-575(4)Yanaihara，Noboru；Kato，Ikuo；Nagasawa，Shingo；Kodaira，Tsukasa.Immunoassay for phthalic acid esters.US 6399318 B1，2002-7-4
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，以弥补现有技术的不足和缺陷，满足生产和生活以及某些领域发展的需要。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案之一是一种抗邻苯二甲酸二丙酯抗体，它是由式(I)表示的邻苯二甲酸二丙酯人工全抗原作为免疫原，通过常规方法得到的。其中，式(I)表示的邻苯二甲酸二丙酯人工全抗原是这样得到的将4-氨基邻苯二甲酸二丙酯(II)与浓HCl和H2O混合，4-氨基邻苯二甲酸二丙酯与浓HCl的物质的量的比为1∶2.5，浓HCl与H2O的体积比为1∶30，加热80℃溶解后，置冰浴中冷至5℃，低温搅拌下，滴入NaNO2的水溶液，4-氨基邻苯二甲酸二丙酯与NaNO2的物质的量的比为1∶1.0，NaNO2与H2O的质量比为1∶80。继续反应0.5小时，加少量尿素除去未反应的NaNO2。将牛血清白蛋白(BSA)的硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.20)逐滴加入上述重氮盐中，BSA与4-氨基邻苯二甲酸二丙酯的物质的量的比为1∶50，载体蛋白的质量与硼酸钠缓冲溶液的体积比为4.0×10-3g/mL，同时用0.5mol·L-1NaOH溶液调节pH值，直至有橙红色溶液出现，继续反应2小时，得抗原粗品。将反应液装入透析袋，置中性蒸馏水透析5天，每天换水2次，将获得的橙红色产品冷冻干燥，分装冻存。其中，上式(II)表示的半抗原衍生物是这样制得的 4-硝基邻苯二甲酸二丙酯(IV)的合成(步骤A)将式(III)表示的4-硝基邻苯二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗邻苯二甲酸二丙酯抗体，其特征在于：它是由式（Ⅰ）表示的邻苯二甲酸二丙酯人工全抗原作为免疫原，通过常规方法得到的。＊＊＊（Ⅰ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：庄惠生，张明翠，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]