一种脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法，包括材料和制备工艺。本发明专利技术采用脑膜炎球菌粗制多糖、溴化氰、碳化二亚胺、蒸馏水、乙腈、盐酸、氯化钠和氢氧化钠材料，通过溶液预备、溶糖、活化、衍生、超滤的制备工艺，在确保氧乙酰基含量符合标准的前提下，提高脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率的技术方案，克服了现有技术存在衍生率难以提高的问题与不足，使脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备，达到了提高衍生率的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法
本专利技术涉及疫苗中间体的制备方法，具体是指用于制作Y群或者W135群脑膜炎球菌结合疫苗的中间体的一种脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法。
技术介绍
名词定义脑膜炎球菌：脑膜炎球菌(meningococcus)的学名是脑膜炎奈瑟氏球菌(n.meninyitidis)，为流行性脑脊髓膜炎(流脑)的病原菌。现引起人体病变的菌株分型主要有A群、B群、C群、Y群及W135群。脑膜炎球菌多糖疫苗：提取特定菌株脑膜炎球菌的细菌外荚膜多糖，经制剂成疫苗，用于预防该菌株脑膜炎球菌的侵袭感染。脑膜炎球菌结合疫苗：提取特定菌株脑膜炎球菌的细菌外荚膜多糖，将荚膜多糖与特定的蛋白或多肽进行偶联，制备成结合物，再经制剂成疫苗，用于预防该菌株脑膜炎球菌的侵袭感染。荚膜多糖：细菌细胞壁外荚膜中的主要成分，可以是同多糖或异多糖。衍生物：将荚膜多糖经过化学手段修饰，形成易于蛋白或多肽进行偶联的一种中间体。衍生率：评价衍生物制备工艺的关键性参数指标，是影响到结合物质量标准的重要环节参数。氧乙酰基：许多细菌荚膜多糖中都存在氧乙酰基，氧乙酰化修饰发生在多糖合成后，其对细菌的免疫原性有重要的意义。由于流脑多糖疫苗在2周岁以下的婴幼儿体内所诱生的抗体持续时间短，不能诱导免疫记忆，因此只对成人具有持久免疫作用，而对婴幼儿则无持久免疫作用。因此，采取多次重复免疫接种，使婴幼儿安渡脑膜炎流行季。研究表明，流脑多糖疫苗中的荚膜多糖CPS为胸腺非依赖性抗原TI-Ag，采用将多糖与蛋白载体偶联，可使胸腺非依赖性抗原TI-Ag转变为胸腺依赖性抗原TD-Ag，从而改变荚膜多糖CPS的抗原性质，可增强免疫原性，诱导出免疫记忆，由多糖/蛋白结合制备的脑膜炎球菌结合疫苗，简称流脑结合疫苗，能够为2岁以下婴幼儿提供长期抗流脑的免疫作用。结合疫苗的制备方法主要分为直接结合和使用接头两类：直接结合法，一般限于羧基和具有一级胺基的醛基之间的缩合反应(酰胺键的形成或酰胺化)，其产物需进一步还原才能稳定，如还原胺化法(reductiveamination)，还原胺化法已成功地用于制备Hib、脑膜炎双球菌结合疫苗。使用接头法，采用适宜的探头将蛋白同多糖进行桥接偶联，进而形成稳定的结合物。如碳化二亚胺法，可采用碳化二亚胺ADH作为探头，在碱性条件下用CNBr活化多糖，然后将活化的多糖与ADH反应形成PS-ADH衍生物，之后在EDC的介导下与蛋白载体形成稳定的结合物。CNBr-ADH方法已成功地用于制备痢疾杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎双球菌结合疫苗、Hib结合疫苗的。本文涉及使用接头法中用于制备Y群或者W135群流脑结合疫苗的衍生物中间体的一种方法，该衍生物中间体的全称分别为：Y群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物；各生物制剂厂家制备脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的工艺及参数各异，所获得的衍生物质量不尽相同，致使所制备的结合物，即，流脑结合疫苗的品质难以一致；制备衍生物的衍生工艺是决定结合物的免疫原性、安全性和收获率的关键，其难点在于，衍生物的衍生率与氧乙酰基含量呈非线性、此消彼长、难以控制的关系；现有技术在确保氧乙酰基含量符合中国药典2015版，Y群脑膜炎球多糖氧乙酰基含量要求不低于0.3mmol/g标准的前提下，所制备的Y群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率为0.50％～1.50％，偏低；若将衍生率提高至2.00％，则氧乙酰基含量明显下降至低于标准；现有技术在确保氧乙酰基含量符合中国药典2015版，W135群脑膜炎球多糖氧乙酰基含量要求不低于0.3mmol/g标准的前提下，所制备的W135群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率为0.50％～1.20％，偏低；若将衍生率提高至1.50％，则氧乙酰基含量明显下降至低于标准；因此，现有技术存在衍生率难以提高的问题与不足。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题与不足，本专利技术采用脑膜炎球菌粗制多糖、溴化氰、碳化二亚胺、蒸馏水、乙腈、盐酸、氯化钠和氢氧化钠材料，通过溶液预备、溶糖、活化、衍生、超滤的制备工艺，在确保氧乙酰基含量符合标准的前提下，使脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率得以提高的技术方案，提供一种脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法，旨在使脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备，达到提高衍生率的目的。本专利技术的目的是这样实现的：一种脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法，包括材料和制备工艺，其中：所述的材料为：脑膜炎球菌粗制多糖；溴化氰，分析纯；碳化二亚胺，分析纯；A溶剂，蒸馏水，分析纯；B溶剂，乙腈，分析纯；盐酸，分析纯；氯化钠，分析纯；氢氧化钠，分析纯；所述的制备工艺，包括溶液预备、溶糖、活化、衍生和超滤，其中：步骤一、溶液预备氯化钠溶液，0.2mol/l，由氯化钠与A溶剂配制而成；C氢氧化钠溶液，0.1mol/l，由氢氧化钠与A溶剂配制而成；D氢氧化钠溶液，0.5mol/l，由氢氧化钠与A溶剂配制而成；盐酸溶液，0.1mol/l，盐酸与A溶剂配制而成；溴化氰溶液，1g/ml，由溴化氰与B溶剂配制而成；碳化二亚胺溶液，0.1mol/l，由碳化二亚胺与所述氯化钠溶液配制而成；步骤二、溶糖取脑膜炎球菌粗制多糖0.102g，置于烧杯中，加入所述氯化钠溶液20ml，用磁力搅拌器搅拌，搅拌转速400转/分钟，搅拌时间30分钟，获得多糖溶液；之后，将盛有多糖溶液的烧杯放入水浴锅中水浴加热，水浴控温为23±3℃，用所述C氢氧化钠溶液调节所述多糖溶液的pH值至pH10.80±0.20，获得J多糖溶液；步骤三、活化在水浴控温23±3℃，搅拌转速400转/分钟的状态下，向烧杯中所述J多糖溶液加入所述溴化氰溶液150μl，进行活化反应，活化时间30分钟，此间，用所述D氢氧化钠溶液控制烧杯中反应物的pH值保持pH10.80±0.20，获得H多糖溶液；之后，用所述盐酸溶液调节所述H多糖溶液的pH值至pH在9.0±0.20，获得JH多糖溶液；步骤四、衍生在水浴控温23±3℃，搅拌转速400转/分钟的状态下，向烧杯中所述JH多糖溶液加入所述碳化二亚胺溶液20ml，进行衍生反应，衍生时间15分钟，此间，用所述D氢氧化钠溶液控制烧杯中反应物的pH值保持pH9.00±0.20，获得Y多糖溶液；之后，将所述Y多糖溶液移至无菌冷库内，在搅拌转速600转/分钟，无菌冷库内温度2～8℃的状态下，进行低温搅拌，低温搅拌用时16小时，获得YP多糖溶液；步骤五、超滤将YP多糖溶液，用超滤机及50kD的超滤膜包进行6次换膜超滤，超滤后的浓缩液，即为脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物。有益效果本专利技术可用于Y群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备，亦可用于W135群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备，具体为：制备Y群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物时，所述材料中的脑膜炎球菌粗制多糖为Y群脑膜炎球菌粗制多糖；制备W135群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物时，所述材料中的脑膜炎球菌粗制多糖为W135群脑膜炎球菌粗制多糖；检测结果：用本专利技术制备的Y群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率为2.12％～3.65％，氧乙酰基含量为0.32～0.38mmol/g；即，本专利技术的衍生率2.12％～3.65％高于现有技术的0.50％～1.50％，本专利技术的氧乙酰基含量0.32～0.38mmol/g符合中国本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法，包括材料和制备工艺，其特征在于：所述的材料为，脑膜炎球菌粗制多糖；溴化氰，分析纯；碳化二亚胺，分析纯；A溶剂，蒸馏水，分析纯；B溶剂，乙腈，分析纯；盐酸，分析纯；氯化钠，分析纯；氢氧化钠，分析纯；所述的制备工艺，包括溶液预备、溶糖、活化、衍生和超滤，其中：步骤一、溶液预备氯化钠溶液，0.2mol/l，由氯化钠与A溶剂配制而成；C氢氧化钠溶液，0.1mol/l，由氢氧化钠与A溶剂配制而成；D氢氧化钠溶液，0.5mol/l，由氢氧化钠与A溶剂配制而成；盐酸溶液，0.1mol/l，盐酸与A溶剂配制而成；溴化氰溶液，1g/ml，由溴化氰与B溶剂配制而成；碳化二亚胺溶液，0.1mol/l，由碳化二亚胺与所述氯化钠溶液配制而成；步骤二、溶糖取脑膜炎球菌粗制多糖0.102g，置于烧杯中，加入所述氯化钠溶液20ml，用磁力搅拌器搅拌，搅拌转速400转/分钟，搅拌时间30分钟，获得多糖溶液；之后，将盛有多糖溶液的烧杯放入水浴锅中水浴加热，水浴控温为23±3℃，用所述C氢氧化钠溶液调节所述多糖溶液的pH值至pH10.80±0.20，获得J多糖溶液；步骤三、活化在水浴控温23±3℃，搅拌转速400转/分钟的状态下，向烧杯中所述J多糖溶液加入所述溴化氰溶液150μl，进行活化反应，活化时间30分钟，此间，用所述D氢氧化钠溶液控制烧杯中反应物的pH值保持pH10.80±0.20，获得H多糖溶液；之后，用所述盐酸溶液调节所述H多糖溶液的pH值至pH在9.0±0.20，获得JH多糖溶液；步骤四、衍生在水浴控温23±3℃，搅拌转速400转/分钟的状态下，向烧杯中所述JH多糖溶液加入所述碳化二亚胺溶液20ml，进行衍生反应，衍生时间15分钟，此间，用所述D氢氧化钠溶液控制烧杯中反应物的pH值保持pH9.00±0.20，获得Y多糖溶液；之后，将所述Y多糖溶液移至无菌冷库内，在搅拌转速600转/分钟，无菌冷库内温度2～8℃的状态下，进行低温搅拌，低温搅拌用时16小时，获得YP多糖溶液；步骤五、超滤将YP多糖溶液，用超滤机及50kD的超滤膜包进行6次换膜超滤，超滤后的浓缩液，即为脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物。...

【技术特征摘要】
1.一种脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法，包括材料和制备工艺，其特征在于：所述的材料为，脑膜炎球菌粗制多糖；溴化氰，分析纯；碳化二亚胺，分析纯；A溶剂，蒸馏水，分析纯；B溶剂，乙腈，分析纯；盐酸，分析纯；氯化钠，分析纯；氢氧化钠，分析纯；所述的制备工艺，包括溶液预备、溶糖、活化、衍生和超滤，其中：步骤一、溶液预备氯化钠溶液，0.2mol/l，由氯化钠与A溶剂配制而成；C氢氧化钠溶液，0.1mol/l，由氢氧化钠与A溶剂配制而成；D氢氧化钠溶液，0.5mol/l，由氢氧化钠与A溶剂配制而成；盐酸溶液，0.1mol/l，盐酸与A溶剂配制而成；溴化氰溶液，1g/ml，由溴化氰与B溶剂配制而成；碳化二亚胺溶液，0.1mol/l，由碳化二亚胺与所述氯化钠溶液配制而成；步骤二、溶糖取脑膜炎球菌粗制多糖0.102g，置于烧杯中，加入所述氯化钠溶液20ml，用磁力搅拌器搅拌，搅拌转速400转/分钟，搅拌时间30分钟，获得多糖溶液；之后，将盛有多糖溶液的烧杯放入水浴锅中水浴加热，水浴控温为23±3℃，用所述C氢氧化钠溶液调...

【专利技术属性】
技术研发人员：马伟，徐伟，郑吉，葛海兵，
申请(专利权)人：浙江卫信生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33