抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增强的奥法木抗体制造技术

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增强的奥法木抗体。本发明专利技术公开了一通过改变奥法木单抗的糖链组成从而获得ADCC活性（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）显著性提升的抗体，该抗体显著提升的活性已在动物体内与奥法木单抗头对头的研究中得到确证。与Biowa公司的Potelligent技术和罗氏的GlycoMab技术通过基因工程在细胞水平进行改造不同的是，本发明专利技术突破性的通过如培养过程中添加岩藻糖类似物等手段，有效调节了细胞的代谢途径而实现了降低或去除目的单抗中岩藻糖含量，实现了显著性提升单抗ADCC活性的目的。

【技术实现步骤摘要】
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增强的奥法木抗体
本专利技术属于基因工程领域，涉及一个通过改变已上市的奥法木(Ofatumumab，Arzerra)单抗的糖链组成，获得抗体依赖性细胞介导的细胞毒性显著性增强的抗体。本专利技术还涵盖了该抗体的制备方法及其在治疗肿瘤，尤其是CD20高表达的慢性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤中的应用。
技术介绍
CD20(亦称为人B淋巴细胞限制性分化抗原)是前B细胞核成熟的B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白(Valentineetal.,J.Bio.Chem.,1989,V264:11282-7)。研究发现，超过90％的非霍奇金氏淋巴瘤患者、慢性淋巴瘤患者及大B细胞淋巴瘤患者B细胞表面高度表达CD20分子(Andersonetal.,Blood,1984,V63:1424-33)，但造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞及其它组织中并未发现前述特征(Tedderetal.,Immunology,1985,V135:973-9)。基于此特征，Biogen公司于1997年上市了特异性针对CD20的人鼠嵌合型抗体Rituxan(Rituximab)，用于治疗慢性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤等，并在临床上成为治疗的金标准。Genmab公司随后在2009年上市了针对CD20大小环区域的全人抗体-奥法木单抗(ofatumumab)，该抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)远高于Rituxan，已被FDA批准用于慢性B细胞淋巴瘤的一线治疗，目前该品种正在进行非霍奇金氏淋巴瘤一线治疗的临床研究。目前抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增强的第三代抗CD20单抗Gavyza(obinutuzumab)已在与Rituxan头对头的临床试验中显示出压倒性的临床优势，证实了ADCC活性在以CD20为靶点的抗体治疗中占据非常核心的地位。Herter等对奥法木单抗(ofatumumab)与Rituxan开展的头对头对比研究表明，奥法木单抗在体外和动物体内的各项活性指标均不逊于Rituxan，且其补体依赖性细胞毒性(CDC)远高于Rituxan(Herteretal.,Mol.Cancer.Ther.2013；12:2031-42)。因此，进一步改善奥法木单抗的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，将赋予其更重要的临床意义。
技术实现思路
基于ADCC活性在CD20抗体临床治疗中的突出作用，及奥法木单抗在ADCC活性的提升空间及可能性，本专利技术通过改变奥法木(ofatumumab)单抗的糖链组成提升其生物学活性，获得一个具有更高生物学活性的新抗体。其抗肿瘤活性的提升在本专利技术中已通过细胞水平的体外试验及动物水平的体内药效试验证实。同时，优选CHO表达系统替代NS0表达系统，从而降低或消除NS0系统表达奥法木单抗时含有的Di-α1,3GalGal糖修饰的组分，使本专利技术单抗具有更低的免疫原性；本专利技术的另一个目的是提供上述单抗的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。本专利技术是通过下列技术措施实现的：一个通过改变奥法木(ofatumumab)单抗的糖链组成提升其生物学活性的抗体及其制备方法。根据所述抗体，其特征在于：其一级氨基酸序列与奥法木(ofatumumab)单抗一级氨基酸序列一致，但其在表达过程中修饰抗体的糖链与修饰奥法木单抗糖链不同，使其生物学活性较奥法木抗体显著增强。根据所述抗体，其特征在于：通过降低修饰抗体的糖链中岩藻糖含量，增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。根据所述抗体，其特征在于：由碳水化合物所组成的修饰抗体的糖链中，具岩藻糖的糖链占修饰抗体的总糖链的质量百分比不高于20％。根据所述抗体，其特征进一步在于：由碳水化合物所组成的修饰抗体的糖链中，具岩藻糖的糖链占修饰抗体的总糖链的质量百分比不高于5％。根据所述抗体，其特征进一步在于：由碳水化合物所组成的修饰抗体的糖链中，不含岩藻糖。根据所述抗体，其特征在于由真核宿主细胞在添加了L-岩藻糖类似物的培养基中翻译表达。根据所述岩藻糖类似物，优选5-炔基-L-岩藻糖、2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖以及他们相应的过酰化衍生物。根据所述岩藻糖类似物，优选2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖以及相应的过酰化衍生物。根据所述岩藻糖类似物，优选2F-Peracetyl-Fucose。根据所述宿主细胞，优选NS0细胞系、SP2/0细胞系及CHO细胞系。根据所述宿主细胞，优选CHO细胞系。一种组合物，所述组合物包含上述抗体。所述的抗体及其制备方法在制备抗肿瘤药物的应用。所述的抗肿瘤药物及其应用，优选慢性淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤。以下主要提供本专利技术的主要步骤：通过降低或去除岩藻糖提升目的单抗ADCC活性的主要技术是集中在细胞基因水平层面上进行改造，如Biowa公司的POTELLIGENT(R)技术和罗氏的GlycoMAb技术。本专利技术突破性的通过调节细胞的代谢途径而实现了降低或去除目的单抗中岩藻糖含量，如培养过程中添加岩藻糖类似物，通过工艺控制对修饰抗体的糖链组成进行调节，达到了显著性提升单抗ADCC活性的目的。抗体在哺乳动物细胞中需要以GDP-fucose为底物，通过岩藻糖转移酶进行α-1,6fucose修饰，细胞内GDP-fucose可以通过利用葡萄糖从头(合成)途径或者利用游离的岩藻糖从补救途径生成。胞内的GDP-fucose水平会对从头(合成)途径的酶(如GMD)产生反馈抑制，或者抑制岩藻糖转移酶的活性，从而影响核心岩藻糖修饰。通过在培养过程中添加岩藻糖类似物，如2F-Peracetyl-Fucose(简称2F)，形成GDP-2F-fucose，抑制正常的GDP-fucose的合成，并且抑制岩藻糖转移酶活性，从而获得低岩藻糖含量的糖链抗体，该抗体较奥法木单抗具有更高的ADCC活性。同时，该法较通过基因工程化改造细胞(如格黎卡特生物技术股份公司申请专利方法，CN02818173.5)更加便捷，抗体产量也显著增加。本专利技术的有益效果本专利技术主要的优点：获得的抗体保持与奥法木单抗相似的安全性同时，获得更高的ADCC活性，这种改变在临床上将有益的降低因患者对抗体发生治疗性抵制的几率。基于本专利技术所制备的单抗，在临床的药效及安全性方面都显著高于现有的奥法木单抗，具有显著的先进性，也符合我国生物医药开发方面的引进、消化再吸收的开发理念，降低了药物开发的风险。附图说明图12F-Peracetyl-Fucose处理的抗体ADCC提升单抗的MS图谱。图25-Alkynyl-Fucose处理的抗体的MS图谱图3CHO表达的奥法木单抗MS图谱。图4原研奥法木单抗MS图谱。图5抗体修饰糖链的示意图。图6奥法木单抗通过修饰糖链ADCC活性改变前后其动物体内抑瘤效果比较具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述，但不限制本专利技术。在此，我们证明了本专利技术中制备的抗体与奥法木单抗相比：通过降低抗体中修饰糖链的岩藻糖含量，获得较奥法木单抗具有更高的ADCC活性的抗体，在体内出示了更强的抗肿瘤活性。实施例1用不同岩藻糖类似物制备岩藻糖敲除的抗体在本专利技术中，基于稳定表达奥法木单抗的CHO(DG44)来源的细胞株ET-4-66(其筛选过程参见于鹏展等，对蒙古人和高加索人种低免疫原性的抗CD20的人抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个通过改变奥法木（ofatumumab）单抗的糖链组成提升其生物学活性的抗体。

【技术特征摘要】
1.一个通过改变奥法木（ofatumumab）单抗的糖链组成提升其生物学活性的抗体。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：其一级氨基酸序列与奥法木（ofatumumab）单抗一级氨基酸序列一致，但其在表达过程中修饰抗体的糖链与修饰奥法木单抗的糖链不同，使其生物学活性较奥法木抗体显著增强。3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：通过降低修饰抗体的糖链中岩藻糖含量，增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：由碳水化合物所组成的修饰抗体的糖链中，具岩藻糖的糖链占修饰抗体的总糖链的质量百分比不高于20%。5.根据权利要求4所述的抗体，其特征进一步在于：由碳水化合物所组成的修饰抗体的糖链中，具岩藻糖的糖链占修饰抗体的总糖链的质量百分比不高于5%。6.根据权利要求5所述的抗体，其特征进一步在于：由碳水化合物所组成的修饰抗体的糖链中，不含岩藻糖。...

【专利技术属性】
技术研发人员：于鹏展，吴伟，范林萍，
申请(专利权)人：西藏海思科药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：西藏,54