血小板糖蛋白IB-α变体融合多肽及其用法制造技术

本发明专利技术涉及一种组合物以及其在预防和治疗血管相关疾病中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
与血管相关的疾病的负面作用，比如中风、心脏病、动脉硬化，被认为至少部分是由血管炎症及其修复反应所引起的。血管炎症及修复反应包括血液循环中的多种类型细胞之间的交互粘附作用。此方面的例子可能出现在血小板、白细胞和血管内表面(也就是血管内皮)之间。在流体剪向冲击力较大的条件下，血小板会通过其表面的Ib-IX-V糖蛋白复合体和位于血管内皮外膜的血管性血友病因子之间的交互作用而粘附在血管的内皮上。此外，附着在血管内皮上的血小板还会在v-WF(血管性血友病因子)作用的范围内粘附血管血液中的其他血小板，从而使血小板层叠形成的血栓增厚。由GPIb-IX-V形成的GPIα链也使得α-凝血酶更容易附着到血小板的表面，从而加强了GPV和活性蛋白酶受体(PARs)的凝血酶促进分裂。与此相对的是，白血球也可以直接粘附于活性血管内皮，或间接得通过由vWF固定的血小板附着.在这两种情况下，白血球细胞表面的粘附在选择蛋白或整联蛋白组粘合受体的分子都会促进这样的粘附过程.一般认为，白血球-血小板之间的粘合，至少部分是由于，白血球表面的整联蛋白分子MacI和血小板表面的GPIb-IX-V联合体成分的交互作用而出现的。在血管疾病出现时，比如动脉硬化斑破裂，或者由血管成形术、动脉狭窄、心肺替代管手术、局部缺血损伤或狭窄引起的机械损伤，发生时，白血球或血小板会在损伤部位堆积并且由于彼此可作为另一层的底层使这种堆积成倍增长。白血球和血小板的这种堆积会产生多种因子，包括促细胞分裂原、细胞因子和趋化因子，这些因子促使血管疾病向着不理想的方向进一步发展。包括来自于GPIα的v-WF粘合区域的用于治疗的多肽已经被公开。其中之一的多肽基于这样一个序列，该序列是包含两个氨基酸取代物(G233V，M239V)的野生型人类的GPIα氨基酸序列。一个Ig融合蛋白包含290个细胞外氨基酸，受v-WF粘合作用主导的这种变异体能够抑制冠状动脉血栓。专利技术简述本专利技术提供了一种糖蛋白IB-α高级变体多肽，可用于作为血管疾病的治疗药物。在不同的实施方案中，这种变体至少表现出一种下述一种性质低聚合性、强稳定性以及对凝血酶的弱束缚作用。这种变体的作用之一是作为融合蛋白用以治疗与血管炎症、血栓、动脉硬化以及血管成形术后的再狭窄相关的血管症状。一方面，相对于，具有人类自然的GPIα氨基酸序列(序列代码1)的多肽，或者相对上述序列包含了两个氨基酸取代物G233V和M239V的名为GPIb2V的多肽，这两者与α凝血酶的粘附而言；本专利技术的多肽与α凝血酶的粘附具有较低的免疫亲合力。当多肽与α凝血酶的粘附具有较低的免疫亲合力时，更多的凝血酶可用于血栓形成过程，在某一过程中可减少不希望的流血。显示出可以减少凝血酶粘附作用的多肽的例子，是那些包括一个、两个或者三个氨基酸取代物Y276F、Y278F、Y279V的代码为1和2序列，或者其保守变体。在一些实施方案中，相对于包含代码为1和2的氨基酸序列的多肽的聚合性来说，本专利技术的多肽的聚合性低。在某些例子中，细胞中本多肽合成过程中也发现具有低聚合性。一个这方面的例子是，包含了C65S氨基酸取代物的多肽或其保守变体，相对于代码为1和2的氨基酸序列来说，具有低聚合性。在一些实施方案中，本专利技术的多肽相对于包含代码为1和2的氨基酸序列的多肽，对蛋白质水解具有较强的耐性。一个这方面的例子是包含了K237V的氨基酸取代物的多肽或其保守变体，相对于代码为1和2的氨基酸序列，对蛋白质水解具有较强的耐性。本专利技术的多肽的合适例子是那些，相对于代码为1和2的氨基酸序列，包含下述氨基酸序列取代物Y276F，Y276FK237V，Y276FC65S，Y276FY278FY279F，Y276FY278FY279FK237V和Y276FY278FY279FC65S。本专利技术的多肽可以作为融合蛋白。例如，糖蛋白Ibα融合蛋白可以包括一条包含至少糖蛋白IB-α多肽变体一部分的多肽，与第二条肽链连接。在一些例子中，这个第二条肽链形成多聚体，比如二聚体。在另一些例子中，这个第二条肽链至少包括免疫球蛋白多肽链的一部分。本专利技术同样提供了糖蛋白-Ibα变体多肽的核酸编码，及载体、细胞和用糖蛋白-Ibα变体多肽编码核酸表达这种糖蛋白-Ibα变体多肽的方法。本专利技术同样进一步提供了，糖蛋白-Ibα变体融合多肽的的核酸编码，以及这种编码的核酸的载体，以及一种含有这种载体或核酸的细胞。本专利技术也提供了一种通过连接与糖蛋白Ibα融合多肽的而抑制白血球粘合到生物组织的方法。大量的白血球被连接足以抑制白血球和生物组织的粘附。在另一方面，本专利技术提供了一种治疗与血小板活化有关的血管疾病的途径。这个途径包括在某一过程中使用有效剂量的糖蛋白Ibα融合多肽。本专利技术还包括了，用于治疗的，包括糖蛋白Ibα变体多肽或糖蛋白Ibα变体融合多肽的化合物。除非另有说明，本文中所有的科学和技术术语的含义均为本专利技术所属领域的通用含义。尽管多种方法，和近似或等同于本文中的原料，可以用于实践或检验本专利技术，下面将会描述合适的实施方式。本申请中对所有出版物、专利申请文件、专利，和其他参考文献，都作为整体来参考。除非有冲突，其所用的描述包括定义，有约束力。此外，本申请中所提到的材料、方法和实施例仅是用来说明，而不用来限制。本专利技术的其他特点和优点，将在以下的详细说明和权利要求中，显现出来。附图说明图1表示GPIbα嵌合体对瑞斯托菌素引起的人体血小板凝集作用的抑制作用。Y轴代表野生型GPIbα(“正常”)和GPIbα-IgWT、GPIbα-290/2V-Ig，GPIbα-290/2V/FFF-Ig的嵌合体的光透过率。图2表示GPIbα嵌合体，在冠状动脉血栓的犬牙Folts’模型下的，抗血栓形成的效能。(Y轴LCX blood)。图3表示在由PFA-100评估的冠状动脉血栓犬牙模型下，GPIbα-290/2V-Ig和GPIbα-290/2V/FFF-Ig对血小板功能的抑制作用。本专利技术详细描述根据本专利技术，糖蛋白Ibα衍生的多肽具有对α凝血酶的低粘附性、低聚合性，和/或对蛋白质水解的高抵抗力，可以作为治疗制剂用于多种情况，可以抑制由活性血小板细胞与血管细胞上的血管性血友病因子的粘附。在一些情况中，本多肽可以用作融合多肽。本专利技术的蛋白质变体具有低凝血酶粘合性，可减少流血。凝血酶和血小板GPIbα受体的粘附是血液凝结所必须的。凝血酶与治疗性的可溶解GPIb的粘附，由于将凝血酶与血小板GPIbα受体隔离开来减少了凝血酶诱导的血小板凝集，增加了有机体内的出血。本专利技术的蛋白质变体显示出了对凝血酶的低亲合力，这就使得更多的凝血酶可参与与血小板GPIbα受体间的交互作用，从而加强了血液凝结。合适的这样的多肽包括这样的氨基酸序列，相对于下述的，包含65-279个氨基酸的，代码1的原生GPIbα蛋白序列和代码2的氨基酸序列所代表的GPIb2V变体来说，在其间具有1到15个氨基酸被取代、缺失或插入。在一个或多个例子中，这种多肽表现出下面的一种或多种活性(i)相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸序列的多肽来说，对α凝血酶具有较低的粘附性；(ii)相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸序列的多肽来说，具有低聚合性；或(iii)相对于包含代码为1和2的人体的氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，相对于人体ＧＰＩｂα蛋白质序列（序列代码１）的氨基酸１－２９０，包含了１－２０个氨基酸取代物、缺失或插入的氨基酸序列，该多肽至少具有选自下列组分之一的活性：相对于包含序列代码２的氨基酸序列的多肽，对α－凝血酶具有低亲合力 ；相对于包含序列代码２的氨基酸序列的多肽，具有低聚合性；相对于包含序列代码２的氨基酸序列的多肽，对水解有高抵抗力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷肖，黛安妮S萨科，雷文德里库玛，徐瑾，
申请(专利权)人：韦思公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]