本发明专利技术提供一种基因工程重组蛋白，即重组人Ａ２０蛋白（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ａ２０，ｒｈＡ２０）。属于基因工程产品及其用途领域。它是将ＨＩＶ－１ Ｔａｔ的穿膜结构域和人Ａ２０的抗炎功能域融合而成的重组蛋白。本发明专利技术还提供了该重组蛋白的氨基酸序列。该重组蛋白具有主动进入哺乳动物细胞、抑制核转录因子ＮＦ－ｋＢ活性、下调促炎细胞因子表达的功能，适用于治疗临床各种炎症性疾病，尤其是用于全身性失控性炎症的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因工程重组蛋白重组人A20蛋白，及其用于临床各种炎症相关性疾病的治疗，尤其是用于全身性失控性炎症的治疗。
技术介绍
炎症可发生于机体的任何部位和任何组织，适度的炎症反应是机体的一种正常免疫防御机制；过度的炎症反应则会引起组织器官损伤，导致临床炎性疾病的发生。研究发现，体内过度的炎症反应与一种被称为NF-κB的核转录因子过度活化有关。促炎细胞因子、病原微生物感染、组织缺血缺氧、化学毒物损伤、电离辐射损伤等刺激，都可以激活细胞内的NF-κB，活化的NF-κB进入到细胞核内与其相应的DNA序列结合，使促炎细胞因子(TNFα、IL-1、IL-2、IL-6等)、产炎症介质酶类(如NO合成酶、环氧化酶等)、黏附分子(如E选择素、ICAM-1、VCAM-1等)等的表达上调。促炎细胞因子中的TNF α、IL-1等反过来又进一步刺激细胞，通过与他们各自相应的膜受体的结合，引起NF-κB更进一步活化，以至于生成更多的促炎细胞因子……形成炎症的级联放大环，最终引起炎症反应过度，甚至发生失控。此时，体内促炎细胞因子和抑炎细胞因子之间的平衡被破坏，同时伴有免疫机能紊乱发生。因此，抑制过高的NF-κB活性、恢复促炎细胞因子和抑炎细胞因子平衡对于临床炎性疾病的治疗十分重要。回顾人们曾经使用过的抗炎治疗药物，其中的糖皮质激素虽然是NF-κB活性的有效抑制物，但是副作用大；抗氧化剂类，如乙酰半胱氨酸，对NF-κB活性的抑制作用较弱且效果不确定；阿司匹林和水杨酸钠虽然也可以抑制NF-κB活化，但是发挥作用必须使用异常高的浓度；天然抑制物如曲霉来源的glyotoxin对人的毒性太大。人们曾经用抗TNF α抗体、IL-1受体拮抗剂等生物工程产品进行治疗，都未能得到明显的治疗效果。美国礼来公司近期推出的重组人活化蛋白C虽然具有明显的抗炎特性，但是同时也是一种强效抗凝物质，可以引起严重的出血并发症如颅内出血等，因此其临床应用受到很大的局限。总之，开发新型抗炎药物仍然是人们面对的挑战之一。1990年人们发现了A20蛋白，近年的研究结果证实A20是一种体内组织细胞NF-κB活化后合成的一种C2/C2型锌指蛋白。各种炎症诱发因素刺激细胞，细胞都可以表达A20。A20表达后存在于细胞浆中，通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方式抑制NF-κB活性，导致体内促炎细胞因子TNF α、IL-1、IL-6等表达的下调、以及介导细胞炎症反应的关键性膜受体TLR4表达的下调。由于A20表达后及时下调了TNFα水平，对过高TNFα引起的组织细胞凋亡呈现出保护性效果。目前已经证实，A20的表达见于临床脓毒血症、类风湿性关节炎、炎性肠病、慢性肝炎、糖尿病、动脉粥样硬化等多种炎症性疾病，在这些疾病中，A20的表达与炎症抑制和炎症时的组织细胞内源性保护有关。因此，开发基于人A20蛋白氨基酸序列的炎症治疗性基因工程药物，具有特异、高效的特点。遗憾的是，A20蛋白为胞浆蛋白，无论是从动物组织中直接分离得到的A20蛋白，还是采用原核表达和/或真核表达获得的人A20蛋白，都不能进入细胞，也就无法实现其抗炎作用。为了克服天然人A20的上述缺点，我们设想通过对天然人A20蛋白的改造，赋予其能够进入细胞并发挥抗炎作用的能力。HIV-1Tat蛋白是HIV-1的转录活化因子，含86～102个氨基酸残基，将Tat蛋白作为爱滋病预防和治疗性接种疫苗的研究已有报道(用于预防和治疗接种的HIV-1TAT或其衍生物，申请号98812496.3)。研究发现，HIV-1Tat蛋白有一个碱性区域，是介导HIV-1进入细胞的关键，其中第49位～57位氨基酸是介导HIV-1进入细胞的最小单元——称HIV-1Tat的穿膜结构域。因此，我们设想将HIV-1Tat蛋白穿膜结构域与人A20抗炎功能域，通过基因工程操作进行融合，希望得到一个能够主动进入细胞同时兼有人A20蛋白抗炎功能的重组人A20蛋白，用于临床炎症性疾病的治疗，尤其是用于全身性失控性炎症的治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够进入细胞、抑制细胞NF-κB活性、下调促炎细胞因子表达的重组人A20蛋白，单独或作为一种组分用于治疗临床炎症性疾病，尤其是全身性失控性炎症的治疗。本专利技术的另一个目的是提供该重组蛋白的氨基酸序列。本专利技术的再一个目的是提供了该重组蛋白单独或作为一种组分在临床炎症性疾病治疗，尤其是在全身性失控性炎症治疗中的用途。本专利技术提供的重组人A20蛋白，HIV Tat蛋白穿膜结构域位于其氨末端，人A20抗炎功能域位于其羧末端，两者之间由一个连接肽将它们连接起来，以确保两者翻译后的正确折叠。该重组蛋白具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，分子量为93kD。SEQ ID NO11 YVRKKRRQRRRSGGS1516GSGGGGEFVLPQALY3031LSNMRKAVKIRERTP4546EDIFKPTNGIIHHFK6061TMHRYTLEMFRTCQF7576CPQFREIIHKALIDR9091NIQATLESQKKLNWC105106 REVRKLVALKTNGDG120121 NCLMHATSQYMWGVQ135136 DTDLVLRKALFSTLK150151 ETDTRNFKFRWQLES165166 LKSQEFVETGLCYDT180181 RNWNDEWDNLIKMAS195196 TDTPMARSGLQYNSL210211 EEIHIFVLCNILRRP225226 IIVISDKMLRSLESG240241 SNFAPLKVGGIYLPL255256 HWPAQECYRYPIVLG270271 YDSHHFVPLVTLKDS285286 GPEIRAVPLVNRDRG300301 RFEDLKVHFLTDPEN315316 EMKEKLLKEYLMVIE330331 IPVQGWDHGTTHLIN345346 AAKLDEANLPKEINL360361 VDDYFELVQHEYKKW375376 QENSEQGRREGHAQN390391 PMEPSVPQLSLMDVK405406 CETPNCPFFMSVNTQ420421 PLCHECSERRQKNQN435436 KLPKLNSKPGPEGLP450451 GMALGASRGEAYEPL465466 AWNPEESTGGPHSAP480481 PTAPSPFLFSETTAM495496 KCRSPGCPFTLNVQH510511 NGFCERCHNARQLHA525526 SHAPDHTRHLDPGKC540541 QACLQDVTRTFNGIC555556 STCFKRTTAEASSSL570571 STSLPPSCHQRSKSD585586 PSRLVRSPSPHSCHR600601 AGNDAPAGCLSQAAR615 616TPGDRTGTSKCRKAG630631CVYFGTPENKGFCTL645646CFIEYRENKHFAAAS660661GKVSPTASRFQNTIP67567本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人Ａ２０蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨末端为ＨＩＶ－１Ｔａｔ穿膜结构域，羧末端为人Ａ２０的抗炎功能域，两者之间由一个中间连接肽连接起来。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴丽娟，蒋建新，朱佩芳，王正国，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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