本发明专利技术公开了一种来源于蛇毒的同活化Ｃ蛋白功能相似的蛋白质，用于脓毒症的预防和治疗。本发明专利技术还公开了该蛋白的制备方法，可采用阴离子交换和凝胶过滤相结合的层析技术从蛇毒中分离纯化。本发明专利技术公开的蛋白可应用于制备预防和治疗脓毒症的药物，同活化Ｃ蛋白相比，具有来源方便，生产简单易行，成本低等优点，有着非常重要的经济和社会意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于预防和治疗脓毒症的蛋白质，具体地说是一种同活化C蛋白功能相似的用于预防和治疗脓毒症的蛋白。
技术介绍
脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，是导致人类死亡的一常见病种，它有极高的发病率和死亡率。(Alerti C，Brun-Buission C，Burchardi H，etal.Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentercohort study.Intensive Care Med，2002，28(2)108-121.)脓毒症是指由感染或者有高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合症，其病原菌包括细菌、真菌、寄生虫及病毒等，临床症状包括但不限于(1)体温＞38℃或＜36℃；(2)心率＞90次/分钟；呼吸＞20次/分钟或PaCO2＜32mm Hg；(4)外周血白细胞计数＞12×109/L，＜4×109/L或成熟粒细胞＞10％；(5)器官功能障碍，高灌注或高血压。(王正国.脓毒症研究概况.中华创伤杂志，2003，19(1)5-7.)自20世纪80年代以来，随着对脓毒症发病机制研究的深入，开发各种旨在抑制脓毒症形成的药物也随即兴起，并进行了80多项临床试验，其中几个有希望的药物进行了III期临床试验，但是遗憾的是仅有一个药物(活化C蛋白)被开发成功。(PoldermanKH and Girbes ARJ.Drug intervention trials in sepsisdivergent results.Lancet，2004，3631721-1723.)。活化C蛋白(商品名为Xigris)的开发成功为新的治疗严重脓毒症药物的开发提供了借鉴，特别是在天然产物中寻找同其功能相似的物质，在此称为活化C蛋白样酶(activated protein C like enzyme)。由于在静脉血栓病人中约有64％的患者对活化C蛋白是抗性的，所以这部分病人患脓毒症后再用Xigris治疗肯定是无效的，而活化C蛋白样物质就可以弥补Xigris的不足。另外，Xigris的生产过程复杂，生产成本较高，每个病人一个疗程的费用约为6800美元，如此高的价格限制了它在临床上的广泛应用。以上这些原因使得活化C蛋白样酶的寻找和开发有着非常重要的经济和社会意义。(，冯军，赵文杰.活化C蛋白.国外医药——合成药、生化药、制剂药分册，2002，23(6)348～351.)我国有着丰富的蛇毒资源，在世界各地分布的500多种毒蛇，在我国就有150多种。蛇毒是一种混合物，它含有许多种类具有不同生物活性的蛋白质，其中很多蛋白质作用于人血液系统的成分。(Markland FS.Snake venoms and the hemostatic systemToxicon，1998，36(12)1749～1800.)但是，至今没有发现利用蛇毒单一组分进行预防和治疗脓毒症的报道。基于活化C蛋白被成功开发为治疗严重脓毒症药物和蛇毒中存在多种作用于血液系统的组分，有必要提出从蛇毒中寻找活化C蛋白样酶，进行治疗脓毒症创新药物的开发。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供一种用于预防和治疗脓毒症的蛋白质，以克服现有技术的不足。本专利技术需要解决的另一个技术问题是提供这种蛋白在制备治疗脓毒症的药物中的应用。本专利技术公开了一种蛋白质，是由124个氨基酸残基组成的活化C蛋白样酶，在体外它既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物，在体内它能显著降低脓毒症试验动物的死亡率。上述活化C蛋白样酶可以是从天然产物提取的也可以是用基因工程手段制备的重组活化C蛋白样酶。上述活化C蛋白样酶的分子量在15.3kD(±5000kD)。上述活化C蛋白样酶的一级结构如附图4所示的氨基酸序列组成。其氨基酸序列如SEQ ID NO1Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys5 10 15Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp20 25 30Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe35 40 45Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys50 55 60Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys65 70 75Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg80 85 90Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp95 100 105 Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu110 115 120Ser Glu Pro Cys这种预防和治疗脓毒症的蛋白质来源于蝮蛇毒(Agkistrodon halys venom)，但不限于蛇毒。本专利技术还公开了该蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤(1)蛇毒溶于起始缓冲液即Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，然后取出，离心，离心条件为4℃，10000g，30min，取上清；(2)用SOURCE 30Q作为层析介质进行阴离子交换层析分离蛇毒，阴离子层析的柱体积为30ml，流速为5ml/min；用起始缓冲液平衡5倍柱体积；上样量为10ml；先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B)，B从0～100％，洗脱20倍CV；取峰5中的收集液；(3)用截留分子量为3000的醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，层析介质为Superdex 75pre grade，凝胶过滤层析柱体积为150ml；流速为0.5ml/min；PBS缓冲液平衡1倍柱体积；上样量为2ml；PBS缓冲液洗脱1.5倍柱体积；取峰2中的收集液。本专利技术活化C蛋白样酶的制备方法中最优选地原料使用蝮蛇毒(Agkistrodonhalys)，阴离子交换层析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生产的SOURCE30Q，凝胶过滤层析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生产的Superdex 75pregrade。阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定，结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力。分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定，结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力阴离子交换分离层析分离到的峰5经凝胶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯军，赵文杰，朱宝泉，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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