本发明专利技术是抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。其是由名称为：杂交瘤细胞ＬＣＤＶ－Ｖ，保藏号为：ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００６１９的杂交瘤培养细胞分泌的。该单抗具有与淋巴囊肿病毒的分子量范围为１１５ｋＤａ－１２５ｋＤａ的衣壳蛋白发生特异性结合的特性。制备该单抗的方法是从以分离的、淋巴囊肿病毒分子量范围为１１５ｋＤａ－１２５ｋＤａ的衣壳蛋白为抗原开始，采用免疫学方法产生融合的杂交瘤细胞；再采用免疫学的检测筛选方法，筛选出抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体讲是一种，其属于免疫学和分子病毒学交叉
技术介绍
鱼类淋巴囊肿病的病原是淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus，LCDV)。自1997年淋巴囊肿病在我国初次大规模爆发以来，受害鱼类已达10余种，每年养殖的海水鱼类都会因该病大量死亡，造成的直接和间接经济损失达百亿元之巨。由于LCDV是寄生于宿主细胞内的非细胞型超微微生物群体，所以至今也未研究出既能杀伤病毒又不损伤宿主细胞的有效药物。另外，该病毒的隐性感染和鱼类特殊的水生环境，使病毒的感染难以觉察，常常一旦发现症状，即到了无法挽救的地步。特异性结合病毒多肽的单克隆抗体是建立病毒免疫学检测方法及早期诊断技术的必备材料。同时，以特异性结合病毒多肽的单克隆抗体为工具研究不同地域、不同宿主的病毒，可为病毒中和抗体的研制及保护性抗原的确认积累基础材料。另外，特异性结合病毒多肽的单克隆抗体也可用于研究该病毒多肽在宿主体内或细胞中的定位，表达等。目前，国内外尚未有研制淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗牙鲆淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法。本专利技术拟研制特异性结合淋巴囊肿病毒(简称LCDV)的衣壳蛋白的单克隆抗体；填补有关抗鱼类LCDV衣壳蛋白的单克隆抗体研究的空白，为建立淋巴囊肿病早期诊断技术及保护性抗原的研究作出贡献。本专利技术的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。所述的单克隆抗体是由名称为杂交瘤细胞LCDV-V，保藏号为CCTCC-C200619，保藏日期2006年4月26日的杂交瘤培养细胞分泌的。所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是淋巴囊肿病毒衣壳蛋白，该衣壳蛋白分子量范围为115kDa——125kDa。一种制备抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的方法，所述的制备方法是从以分离的、分子量范围为115kDa——125kDa的淋巴囊肿病毒衣壳蛋白为抗原开始，采用免疫学方法产生融合的杂交瘤细胞；再采用免疫学的检测筛选方法，筛选出抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。所述的免疫学的检测筛选方法是间接免疫荧光抗体法，胶体金标记免疫电镜法和免疫印迹法；其中，胶体金标记免疫电镜法和免疫印迹法，这两个检测实验方法结合起来，能够确定该单克隆抗体(以下简称VP单抗)的抗原决定簇在鱼类淋巴囊肿病毒的分子量范围为115kDa——125kDa的衣壳蛋白上。本专利技术的优点在于由于采用了间接免疫荧光抗体鉴定方法，间接免疫荧光抗体法反应灵敏，结果观察直观，能够避免酶联免疫吸附法和免疫酶法等由于细胞和组织内存在内源酶而出现的假阳性结果，所以使得确认VP单抗与LCDV发生的特异性结合反应真实存在。同时，由于采用了胶体金标记免疫电镜方法，它能在超微结构水平上精确、细致的定位，特异性高，标记物清晰可辨，具有其他标记方法无法比拟的优越性，该技术把免疫学中抗原抗体反应的高度特异性、敏感性与组织化学的形态可见性有机的结合起来了，可在亚细胞及分子水平上研究免疫反应。因此采用该方法进一步直观地证实该VP单抗与位于LCDV衣壳蛋白上的抗原决定簇发生了特异性结合反应。本专利技术尤其重要的是采用了免疫印迹法确认了含有该抗原决定簇的病毒衣壳蛋白的分子量，免疫印迹方法是近年来发展起来的一种新方法，具有特异性强、灵敏性高的优点，该方法直接确定了与VP单抗特异性结合的LCDV蛋白多肽的分子量范围为115kDa——125kDa。综合本专利技术的胶体金标记免疫电镜结果和免疫印迹结果可知与VP单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于LCDV的衣壳蛋白上，且该衣壳蛋白的分子量范围为115kDa——125kDa，这一成果为建立LCDV的单克隆抗体早期诊断方法，为从分子水平上定位该病毒的靶器官，为不同地域、不同宿主病毒的区分以及研究该病毒流行病学规律奠定了坚实的基础。此外，特异性结合LCDV多肽的单克隆抗体不但能用于研究病毒多肽在宿主体内或细胞中的定位，表达等，也可利用单抗与相应抗原决定簇相结合抑制该抗原的特性，研究病毒抗原表位的定位，抗原表位的数量和相互关系。它为进一步弄清病毒的抗原位点，不同位点之间的关系，不同位点与不同生物学功能之间的关系，以及选择保护性位点，制备亚单位疫苗提供理论依据。附图说明图1为间接免疫荧光抗体法检测结果图。图2为胶体金标记免疫电镜鉴定结果图。图3为免疫印迹方法测定的结果图。图1中，可见囊肿细胞的细胞质边缘出现散布有块状、楔状的强阳性信号，并且数个成链圈状排列。图2中，可见背景清洁，无散在的金粒子，在LCDV的衣壳上特异性结合有大量的金粒子。图3显示本专利技术的VP单抗和已知LCDV单抗(杂交瘤细胞株保藏编号CCTCC-C200419，专利申请号200410075528.1)的免疫印迹结果。图3中M为分子量标准；V为LCDV的电泳图谱，可见在分子量范围为115kDa——125kDa间仅有一条蛋白多肽；1为抗LCDV的VP单抗的免疫印迹结果，可见VP116单抗能特异性结合一条电泳后的分子量在115kDa——125kDa范围间的蛋白多肽；2为已知LCDV单抗(杂交瘤细胞株保藏编号CCTCC-C200419)与电泳后的分子量在115kDa——125kDa范围间的蛋白多肽不反应的免疫印迹结果。本专利技术所述VP单抗的制备方法，是以分离的、淋巴囊肿病毒分子量在115kDa——125kDa范围间的蛋白多肽为抗原，经免疫balb/c小白鼠，应用免疫学方法，产生杂交瘤细胞，再应用免疫学的检测鉴定方法，筛选鉴定出VP单抗。所述的免疫学的检测鉴定方法是间接免疫荧光抗体法，免疫印迹法和胶体金标记免疫电镜法。应用间接免疫荧光抗体法，有该VP单抗的鉴定结果显示囊肿细胞的细胞质边缘出现散布有块状、楔状的强阳性信号，并且数个成链圈状排列。该结果确认VP单抗与LCDV病毒粒子发生的特异性结合反应真实存在。应用胶体金标记免疫电镜法，有该VP单抗的鉴定结果显示在LCDV病毒粒子的周围特异性结合有大量的胶体金粒子，即表征与该VP单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于LCDV的衣壳蛋白上。应用免疫印迹法，有该VP单抗的鉴定结果显示该VP单抗能特异性结合一条病毒的蛋白多肽，该多肽的分子量范围在115kDa——125kDa间。即表征与该单抗特异性结合的抗原决定簇位于分子量范围在115kDa——125kDa间的蛋白多肽上。胶体金标记免疫电镜法和免疫印迹法这两种检测方法结合起来，能够确定VP单抗的抗原决定簇在淋巴囊肿病毒的分子量范围在115kDa——125kDa间的衣壳蛋白上。具体实施例方式本专利技术VP单抗具体制备方法结合实施例及其附图进一步说明如下实施例1研制抗牙鲆LCDV的VP单抗1.)LCDV病毒提纯(1)取10g病鱼的囊肿组织，加入适量石英砂和10倍体积的TNE缓冲液(0.05mol/L Tris-HCL；0.15mol/L NaCl；0.01mol/L EDTA；pH7.4)，冰浴匀浆；(2)匀浆液4℃，600g离心30min，取上清液；(3)4℃，1 800g再次离心30min；收集上清液；(4)4℃，8 000g离心2h；弃上清，收集沉淀；(5)向沉淀中添加适量TNE，将其轻置于由37本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗鱼类淋巴囊肿病毒衣壳蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞ＬＣＤＶ－Ｖ，保藏号为：ＣＣＴＣＣ－Ｃ２００６１９，保藏日期：２００６年４月２６日的杂交瘤培养细胞分泌的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：战文斌，程顺峰，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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