一种维生素B12适配体亲和柱及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种维生素B12适配体亲和柱及其制备方法和用途。该亲和纯化柱利用化学修饰的固相载体，然后用维生素B12的核酸适配体与载体进行共价偶联。然后装填亲和柱。该适配体亲和柱主要用于对于食品、奶粉、牛奶、饮料以及其他多种样本中的维生素B12的纯化，以便于后期对样本中维生素B12的高效液相色谱（HPLC）检测和质谱检测。

Vitamin B12 ligand affinity column and preparation method and application thereof

The invention relates to a vitamin B12 aptamer affinity column, a preparation method and an application thereof. The affinity column uses a chemically modified solid-phase carrier, followed by covalent coupling with a nucleic acid aptamer of the vitamin B12 and a carrier. Then, the affinity column is loaded. The aptamer affinity column is mainly used for food, milk powder, milk, beverage and other purified samples of vitamin B12, in order to facilitate the post of high performance liquid chromatography of vitamin B12 in the sample (HPLC) detection and mass spectrometric detection.

【技术实现步骤摘要】
一种维生素B12适配体亲和柱及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种维生素B12的适配体亲和柱及其制备方法和用途。属食品检测领域。
技术介绍
维生素B12是唯一一类含有主要矿物质钴的维生素，故又名钴胺素，包括氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺。通常狭义上所指维生素B12是氰钴胺，它是食品和营养补充剂中B12的主要形式。B12易溶于水，在吸收时需要与钙结合，大部分为小肠所吸收，人体只能利用甲钴胺和腺苷钴胺，因此氰钴胺要在体内细胞转化成这两种形式才能被人体吸收利用。婴幼儿缺乏维生素B12表现为精神情绪异常、表情呆滞、反应迟钝等，最后导致贫血。婴幼儿过量摄入维生素B12则易导致叶酸缺乏，有些会出现哮喘、湿疹、荨麻疹、面部水肿等过敏性症状。因此我国标准对婴幼儿品配方乳粉中B12的添加量有严格的规定，其中GB14880—2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中儿童调制乳粉中B12的添加量为10～30μg/kg，相关产品国标标准添加限量也在此范围。目前市售婴幼儿乳粉是营养标签中B12的含量大部分在1.5～2.5μg/100g之间。目前食品中维生素的测定方法较多,包括微生物法、比色法、示波法、原子吸收法、高效液相色谱法等。其中微生物分析法灵敏度高,但培养时间长、操作繁琐等缺点，大部分的检验机构不能较好地开展。,原子吸收法受基质钻元素的影响可使结果不准确。高效液相色谱法(HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,目前也被常用于食品中维生素的检测。但因其对样品中维生素纯度的要求较高,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的需要,所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（IAC-HPLC)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术,在维生素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时,其中的抗原与抗体结合,其他杂质则通过水溶液洗掉,再用有机溶剂将抗原即维生素洗脱下来,从而使样品中的维生素得以净化。O.Heudi等使用免疫吸附柱纯化，通过高效液相紫外成功地检测出维生素B12。免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。适配体是一段核酸序列，通常为DNA或者RNA序列。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。Herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[Science287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[Song.TrendsAnaly.Chem2008.27(2)]。核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利CN105505940A中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体DNA传感器。通过黄曲霉毒素B1的适配体，及多条互补探针序列制备DNA传感器，通过酶底物反应，实现黄曲霉毒素B1的检测。在专利CN105400790A中，描述了一种黄曲霉毒素的检测方法。利用黄曲霉毒素B1的适配体与蔗糖酶结合，通过酶与糖底物的相互作用，依靠血糖仪实现黄曲霉毒素B1的检测。上述都是利用黄曲霉毒素适配体实现毒素的检测。在毒素分离中，专利CN104651369A中描述了一种黄曲霉毒素磁性分离方法，将黄曲霉毒素B1核酸适配体序列与磁珠结合，实现分离。在专利CN104399283中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素B1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种维生素B12适配体亲和柱及其制备方法和用途在本专利技术中，我们利用SELEX系统，从适配体文库中筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的维生素B12的RNA适配体。适配体修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到维生素B12的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的维生素B12适配体亲和柱该亲和柱操作简便，纯化维生素B12效率高。能耐受有机溶剂，并且可以重复使用。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的维生素B12。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。具体操作如下：本专利技术最大的优势就是利用了核酸适配体的特性，通过多轮的富集、洗涤、扩增等步骤，筛选出针对维生素B12的特异性适配体。通过序列测定得到适配体的序列核酸适配体相对于抗体来说，具有适应环境广泛，能够耐受高温、能耐受有机溶剂并且操作方便等优点。最主要的，适配体在制备过程中不需要经过动物体内的过程，而是通过化学合成来获得。因此，生产周期短，并且可以通过合成条件保证序列的准确性以核酸适配体为基础制备的亲和柱具有特异性好，维生素B12结合量大，纯化效率高的特点。维生素B12适配体亲和柱及其制备方法说明如下1.选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的琼脂糖载体sepharose4B，进行活化取1gN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml1mM的HCl，溶胀30min后，凝胶用100ml1mMHCl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤2.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO3，0.8MNaCl，PH8.2）洗涤3次。加入20mol/L的氨基修饰的维生素B12适配体，室温偶联8小时3.将偶联好的维生素B12适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次4.封闭将偶联好的维生素B12适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/L的Tris.ClPH8.0，室温反应2小时5.将封闭好的维生素B12适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次6.装柱将维生素B12—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的维生素B12亲和柱。层析柱的结构如附图1所示。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1.本专利技术充分的利用了核酸适配体的优点，通过多轮的筛选和富集。得到了高特异性高亲和力的维生素B12核酸适配体。该适配体能够特异性的结合样本中的维生素B12，降低了抗体亲和柱经常遇到的交叉反应性。亲和柱效率大幅度提高核酸适配体不受操作环境和有机溶剂的影响，尤其适合脂溶性维生素类的脂溶性物质的纯化。相比较，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低此外，由于有机溶剂导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受有机溶剂，可以重复使用多次，大幅度降低了使用成本2.本专利技术使用的核酸适配体可以通过化学合成法获得，可以保证序列的正确性。大幅度降低了不同批次间的变异。而相对来说，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量变异较大，使亲和柱质量存在差别3.使用本专利技术纯化维生素B12操作简便，一步纯化就可以得到纯度较高的维生素B12。更方便操作者使用4.使用本专利技术的产品得到的维生素B12纯度很高，后续不用再做别的纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种维生素B12的适配体亲和柱，其特征在于包含有载体和维生素B12适配体。

【技术特征摘要】
1.一种维生素B12的适配体亲和柱，其特征在于包含有载体和维生素B12适配体。2.根据权利要求1中所述的亲和柱，其特征在于适配体通过化学键偶联在载体上。3.根据权利要求1中所述的亲和柱，其特征在于所述的适配体是核酸适配体，更具体的是寡聚核苷酸适配体。4.根据权利要求3中所述的核酸适配体，其特征在于所述的适配体序列为序列1所描述的核酸序列。5.根据权利要求1中所描述的适配体，其特征在于适配体是经过化学修饰的适配体。6.根据权利要求5中所描述的适配体，其特征在于修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰及生物素修饰。7.根据权利要求1中所述的适配体亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶或者化学合成的固相载体。8.根据权利要求5中所述的亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包含但不限于N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶、溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦明，
申请(专利权)人：北京美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11