一种ＣＹＰ３Ａ４多肽，其特征在于ＣＹＰ３Ａ４多肽的氨基酸序列为：ＳｅｒＧｌｎＡｓｎＳｅｒＬｙｓＧｌｕＴｈｒＧｌｕＳｅｒＨｉｓＬｙｓＡｌａＬｅｕＳｅｒＡｓｐ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多肽及该多肽抗体的制备方法。
技术介绍
人CYP3A4(CYP4503A4)是CYP3A亚家族中一成员，主要在肝脏、小肠中表达。CYP3A4是人类药物代谢酶中重要的酶，临床上CYP3A4可完全或部分代谢超过半数的药物。CYP3A4尤其是与外源性致癌物、抗癌药物和内源性类固醇激素、维生素、脂肪酸的代谢转化密切相关。目前使用的人CYP3A4(ab22702http//www.abcam.com/提供羊抗兔CYP3A4人工合成肽抗体，用于免疫组化、免疫印迹试验。Ab22704http//www.abcam.com/提供兔抗人CYP3A4人工合成肽抗体，用于免疫组化、免疫印迹试验。Ab3572http//www.abcam.com/提供兔抗人CYP3A4基因重组表达全部氨基酸抗体，用于免疫印迹试验。CR3340htto//www.biomol.com/提供兔抗人CYP3A4多克隆抗体，用于免疫组化、免疫印迹试验。CR3345http//www.biomol.com/提供羊抗人CYP3A4多克隆抗体，用于免疫组化、免疫印迹试验。CP0334http//ww.biomol.com/提供兔抗人CYP3A4多克隆抗体，其免疫原氨基酸序列498-502位，用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹和免疫组织化学试验。)价格昂贵，制备的抗体成本过高，而且临床使用存在风险。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决目前使用的人CYP3A4价格昂贵，制备的抗体成本过高，而且安全度低的问题，而提供的一种CYP3A4多肽及抗人CYP3A4多肽抗体的制备方法。CYP3A4多肽的氨基酸序列为SerGlnAsnSerLysGluThrGluSerHisLysAlaLeuSerAsp。抗人CYP3A4多肽抗体按以下步骤制备(一)CYP3A4抗原表位的分析利用DNAStar软件分析，确定CYP3A4蛋白278～292位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP3A4多肽的合成多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP3A4多肽与载体蛋白交联CYP3A4多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法，然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8～12h，交联形成CYP3A4-KLH；(四)制备兔抗CYP3A4多肽抗体将乳化后的CYP3A4-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶10000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP3A4多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP3A4多肽抗体，即得到抗人CYP3A4多肽抗体。本专利技术中的CYP3A4多肽具有优异的亲水性结构(hydrophilicity)、柔性区(flexibility)、抗原指数(antigenicity)及表面概率结构(surface probability)。本专利技术制备的抗人CYP3A4多肽抗体为多克隆抗体，效价高，特异性好，可与天然人CYP3A4分子发生特异结合反应；本专利技术抗体制备成本低，只有用重组抗原制备抗体成本的十分之一，并且安全可靠性高于重组抗原制备的抗体；而且本专利技术制备的抗人CYP3A4多肽抗体能够满足免疫组化、免疫印迹和酶联免疫吸附实验的要求，可用于建立体外免疫分析，为兔抗人CYP3A4分子的研究及相关疾病的研究提供一个有力工具，具有重要的理论意义和临床价值。附图说明图1是DNAstar软件分析人CYP3A4蛋白序列的数据分析结果图；图2是抗血清相对亲和力常数测定结果图，图中“■”曲线为浓度是10mg/L的CYP3A4-BSA的OD450值，图中“▲”曲线为浓度是5mg/L的CYP3A4-BSA的OD450值；图3是抗体Western blot析凝胶电泳图，图中“M”泳道标样为Marker，图中“1”泳道标样为CYP3A4-BSA，图中“2”泳道标样为BSA，图中“3”泳道标样为人肝脏微粒体蛋白；图4是正常人肝脏组织HE染色图(×400)；图5是抗人CYP3A4多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP3A4结合图(×200)；图6抗人CYP3A4多肽抗体与正常人肝细胞胞浆中的CYP3A4结合图(×400)。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式CYP3A4多肽的氨基酸序列为SerGlnAsnSerLysGluThrGluSerHisLysAlaLeuSerAsp。具体实施方式二本实施方式抗人CYP3A4多肽抗体按以下步骤制备(一)CYP3A4抗原表位的分析利用DNAStar软件分析，确定CYP3A4蛋白278～292位15个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列；(二)CYP3A4多肽的合成多肽自动合成仪合成，并纯化；(三)CYP3A4多肽与载体蛋白交联CYP3A4多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法，然后用pH值为8.5的硼酸缓冲液透析8～12h，交联形成CYP3A4-KLH；(四)制备兔抗CYP3A4多肽抗体将乳化后的CYP3A4-KLH在兔背部皮下注射，并反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶10000；(五)收集、分离得到含有兔抗人CYP3A4多肽抗体的血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化CYP3A4多肽抗体，即得到抗人CYP3A4多肽抗体。本实施方式利用DNAStar软件分析CYP3A4蛋白序列，蛋白序列分析结果如图1所示，CYP3A4蛋白278～292位氨基酸(多肽)具有优异的亲水性结构(hydrophilicity)、柔性区(flexibility)、抗原指数(antigenicity)及表面概率结构(surface probability)。本实施方式抗体经过纯化后纯度为96.9％，可作为抗原免疫动物，安全可靠性高。本实施方式中所使用的兔子为健康日本大耳白兔。本实施方式于耳中央动脉采血测定抗体的效价。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式二的不同点是步骤(二)中采用常规C18的RP-HPLC柱进行纯化。其它步骤与实施方式二相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式二的不同点是步骤(三)中CYP3A4多肽与载体蛋白KLH采用戊二醛连接法按重量份数比将4～6份经过纯化的CYP3A4多肽加入到6～8份载体蛋白KLH中，然后均匀、缓慢地加入0.5～1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液，室温环境下作用2±0.5h。其它步骤与实施方式二相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式四的不同点是步骤(三)中的戊二醛溶液配制后3h内使用。其它步骤与实施方式四相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式二的不同点是步骤(四)中取CYP3A4-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，每点注射100μg，首次免疫注射后第2周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同；加强免疫注射CYP3A4-KLH用不完全福氏佐剂乳化；每次加强免疫注射7天后测定抗体效价。其它步骤与实施方式二相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式二的不同点是步骤(四)中反复加强免疫，直至抗体效价等于、高于1∶16000。其它步骤与实施方式二相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式二的不同点是步骤(五)中采用颈动脉取血收集含有兔抗人CYP3A4多肽抗体的兔血。其它步骤与实施方式二相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐晓波，朱大岭，刘海英，杨微，武正华，郭守利，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：
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