抗人腱生蛋白单克隆抗体制造技术

本发明专利技术描述了一种抗人腱生蛋白单克隆抗体，其轻链和重链可变区序列分别是ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１和ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２。本发明专利技术还涉及所述单克隆抗体的能结合人腱生蛋白Ａ↓［（１－４）］－Ｄ区域内的抗原性表位的蛋白水解片段，它的重组衍生物、缀合物及其能结合人腱生蛋白Ａ↓［（１－４）］－Ｄ区域内的抗原性表位的相似功能性类似物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗人腱生蛋白单克隆抗体、获得它们的方法及原料、所说抗体在表达腱生蛋白的肿瘤的诊断和治疗方法中的用途以及含有所述抗体并适于在医疗领域中应用的材料。
技术介绍
肿瘤疗法的专一性通常成为决定治疗是否成功的限制因素。事实上，许多抗癌剂的毒性效果和低耐受性限制了它们的用途以及患者的生活质量。毒性的降低与只针对癌细胞的治疗选择性直接相关。单克隆抗体是适于特异定位于肿瘤的理想工具，而且当它们与亲和素/生物素扩增体系联合时，可成为一种将活性分子定向于肿瘤位点的非常有效的方法。腱生蛋白是一种胞外基质分子，其在胚胎发生期间、疤痕形成过程和肿瘤发生期间的成年组织中、以及新形成的血管中表达。在正常的成年组织中几乎没有腱生蛋白，而在许多实体肿瘤的基质中则有所表达，诸如胶质瘤(Burdon等，Cancer Res.，432796-2805，1983)、乳癌(Chiquet-Ehrisrnann等，1986)、肺癌(Natali等，Inti.J.Cancer，5456-68，1989)、纤维肉瘤和鳞状细胞癌(Ramos，D.M.等，liltl.J.Cancer，75680-687，1998)。腱生蛋白在胶质瘤中表达，但在相应的正常脑组织中则无表达。有关腱生蛋白的深入讨论，读者可参阅专利申请WO 92/04464，Wistar和相关文献。基于专利申请EP 0 496 074，G.Paganelli等人已研发了一种被称为“三步预靶向”的方法用于肿瘤的全身和区域性治疗，其有关结果报道于以下文献中Cremonesi，M.等，Eur.J.Nucl.Med.，26(2)110-120，1999；Paganelli，G.等，Eur.J.Nucl.Med.，26(4)348-357，1999；Paganelli，G.等，Cancer Biother.&Radiopharm.，16(3)227-235，2001；Grana，C.等，Br.J.Cancer，86207-212，2001。有关此类型的癌症治疗方法的其它参考文献有WO 94/04702和US 5,578,287。三步预靶向治疗法，也以商标PAGRIT著称，其基础是依次静脉内施用生物素化抗腱生蛋白单克隆抗体、链霉亲和素和90Y-生物素，在施加链霉亲和素和90Y-生物素之前先分别加入亲和素和生物素化白蛋白(“追踪”步骤)，以降低抗体和链霉亲和素的循环水平。三步预靶向法的选择性是由于使用抗腱生蛋白单克隆抗体造成的。与针对于细胞表面抗原的靶向方式相比较，靶向于胞外基质分子的优势在于不受肿瘤细胞自身对抗原表达的调控的影响。为获得最佳的肿瘤对非肿瘤的生物分布比率，已确定了预靶向疗法的剂量、施用次数和“追踪”步骤。Paganelli研究利用了获自48名成胶质细胞瘤(GBM)或恶性星细胞瘤(AA)患者的结果(Paganelli，G.，et al.，Eur.J.Nucl.Med.，26(4)348-357，1999)，证明该疗法确实无毒性并且有初步的疗效，只是少数病例对链霉亲和素有过敏反应。事实上，治疗结束2个月后，25％的患者显现出肿瘤块缩小(全部有反应＝6％，部分反应＝11％，反应较小＝8％)，52％的患者维持稳定，总响应率为77％。在许多预期存活期在6个月以下的这些患者中，对治疗的反应持续1年以上。生物素化抗腱生蛋白抗体的作用是定位于肿瘤和介质中，通过生物素化的分子，亲和素和随后的90Y-生物素积聚，将放射性同位素直接导向肿瘤内部。抗腱生蛋白抗体已是以下专利和专利申请的对象美国专利申请US 5,624,659，Duke University；JP 2219590，Rikagaku；WO 92/04464，Wistar；以及WO 03/072608，Sigma-Tau。一种特别的抗腱生蛋白抗体被描述在下述文献中Siri，A.等，Nucl.Acid Res.，19(3)525-531，1991；Balza，E.，et al，FEBS 33239-43，1993；而有关它的治疗用途可参阅Riva，P.等，Acta Oncol.38(3)351-9，1999；Riva，P.等，Cancer，80(12)2733-42；1997；Riva，P.等，.Int.J.Cancer，57-13，1992。在上述研究中用于产生所说抗体的克隆被命名为BC-2。申请者已证明克隆BC-2不适于工业开发，因为它产生一额外的非功能性轻链(可能来源于亲本骨髓瘤株系)，在大规模生产过程进行期间，此轻链的表达水平增加，阻碍了工业规模的抗体纯化。因此，人们认识到需要有可在药用所需纯度水平上以工业化规模生产抗腱生蛋白单克隆抗体。早先的专利申请WO 03/072608(申请者为Sigma Tau IndustrieFarmaceutiche Riunite S.p.A.)中描述了抗腱生蛋白抗体ST2146的产生，该抗体无额外的非功能性轻链，能识别与抗体BC-4共享的抗原性表位，所述的抗体BC-4也被非功能性轻链污染了。本专利技术的对象抗体ST2485识别与BC-2所识别表位部分共享的表位，因而位于同一蛋白区域内。此区域在多种肿瘤组织中大量表达。因此，获得特异于此区域的均一单克隆抗体用于癌症诊断或靶向是非常重要的。此外，本专利技术证实，除了ST2146之外，抗体ST2485也具有结合腱生蛋白的优点，因此可用于联合使用这两种抗体的预靶向方法中。专利技术简述现已发现抗人腱生蛋白单克隆抗体解决了上述问题，因为它没有非功能性轻链，且在与另一抗腱生蛋白抗体联合使用时具有加和的优势。此抗体及其制备方法和治疗用途都是本专利技术的对象，尤其是用于制备治疗诸如肿瘤等以腱生蛋白的表达为特征的疾病的产品。本专利技术涉及抗体和抗体片段，其可选地包含额外标记物和诊断剂，还涉及获得所述抗体和抗体片段的方法、含有所说抗体及其片段的药物组合物和利用它们进行诊断和治疗的方法，以及用于执行所说方法的试剂盒。本专利技术还涉及编码所说抗体或其片段的DNA、含有所述DNA的载体、含有所述载体的宿主细胞、由核苷酸序列SEQ ID NO1和SEQ IDNO2编码的蛋白质、编码所述蛋白质及片段的DNA、特异互补决定区(CDR)以及含所述CDR的蛋白质。具体而言，本专利技术的对象还包括产生所述单克隆抗体的杂交瘤。作为本专利技术对象的抗体的特征在于分别如附图说明图17和18所示的轻链和重链SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的可变区序列。为简便起见，作为本专利技术对象的抗体将以名称ST2485表示。此外，ST2485的片段或其嵌合或重组衍生物可在本专利技术范围内产生和应用。此外，本专利技术的对象还包括能与人腱生蛋白A1-4-D区域内的抗原性表位结合的所说抗体的蛋白水解片段。在描述本专利技术的过程中，所谓的抗体片段指能结合人腱生蛋白C的A1-4-D区域内抗原性表位的那些片段。依照本专利技术，所说的抗体或蛋白水解片段优选是生物素化的。本专利技术的另一对象是产生抗体ST2485的杂交瘤细胞系，被称为cST2485。该杂交瘤细胞系在2003年11月12日根据布达佩斯条约的规定被保藏在Centro di Biotecnologie Avanzate，Largo Rossana Benzi 10，Genoa本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗人腱生蛋白单克隆抗体，优选小鼠的，其轻链和重链可变区序列分别是ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１和ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２，它的能结合人腱生蛋白Ａ↓［（１－４）］－Ｄ区域内的抗原性表位的蛋白水解片段，它的重组衍生物、缀合物和能结合人腱生蛋白Ａ↓［（１－４）］－Ｄ区域内的抗原性表位的类似功能性类似物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R德圣蒂斯，A佩利恰，G帕隆博，P卡尔米纳蒂，
申请(专利权)人：泰克诺根公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]