端粒酶活性抑制蛋白的制备和纯化制造技术

本发明专利技术公开了采用基因重组技术制备端粒酶活性抑制蛋白的方法，该方法可以高效地和大规模地制备高纯度和高生物学活性的端粒酶活性抑制蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术和生物化学工程领域。更具体地说，本专利技术涉及采用基因重组技术制备端粒酶活性抑制蛋白的方法，该方法可以高效地和大规模地制备高纯度和高生物学活性的端粒酶活性抑制蛋白。
技术介绍
端粒酶(Telomerase)是一种合成和延伸细胞染色体端粒的核糖核蛋白，它包含两种基本成分逆转录酶催化亚基hTERT和RNA组分hTR。端粒酶能以自身RNA为模板，反转录合成端粒重复列，加到染色体的末端，以弥补细胞分裂时端粒DNA的丢失，维持端粒的长度。研究表明，在正常人体细胞内端粒酶活性几乎检测不到，因此，人正常体细胞分裂次数是有限的，细胞每分裂一次，端粒便丢失50-200bp，当端粒缩短到一定程度时细胞生长受到抑制，即称为细胞衰老，并走向死亡。然而，在绝大多数恶性肿瘤细胞(85％)中普遍可以检测到端粒酶活性且活性较强，端粒酶对端粒的重新合成补偿了它在细胞繁殖过程中的持续丢失，从而使得细胞可以不断的分裂，这是细胞永生化和癌变的一个重要机制。Kim等分析总结了大量研究结果，检测了100多种恶性肿瘤标本，指出端粒酶诊断肿瘤的敏感性为85％，特异性为91％，阳性预测值为91％，阴性预测值为81％，充分表明端粒酶在肿瘤诊断中的价值(Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells andcancer.Science.1994 Dec 23；266(5193)2011-5.)。并认为端粒酶被激活是发生恶性肿瘤的主要因素之一，其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相关，抑制端粒酶并使端粒缩短被认为是抑制癌细胞的一种机制，因此端粒酶成为肿瘤靶向治疗的理想靶点。目前，以端粒酶为靶点的肿瘤治疗研究，主要采用了针对端粒酶RNA组分的反义核酸技术(Kondo S.，Kondo Y.，Li G.，et al，Targeted therapy of humanmalignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomeraseRNA.Oncogene，1998，163323-3330.Ludwig A，Saretzki G，Holm PS，et al.Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizes breast epithelial cells toinhibitors of topoisomerase.Cancer Res，2001，613053-3061；Feng J.，Funk W.D.，Wang S.S.，et al.The RNA component of human telomerase，Science，1995，2691236-1241)、基因治疗技术、切割端粒酶mRNA的核酶技术(Ludwig A，Saretzki G，Holm PS，et al.Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizesbreast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase.Cancer Res，2001，613053-3061)和抑制端粒酶基因转录活性的技术等(Meyerson，M.Counter C.M.，EatonE.N.，et al.hEST2，the putative human telomerase catalytic subunit gene，is up-regulated in tumor cells and during immortalization，Cell，1997，90785-795；W.C.Hahn，S.A.Stewart，M.W.Brooks，S.G.York，E.Eaton，A.Kurachi，R.L.Beijersbergen，J.H.Knoll，MMeyerson，R.A.Weinberg，Inhibition of telomeraselimits the growth of human cancer cells，Nat.Med，1999，5164-1170)。这些技术可以使肿瘤细胞的端粒缩短，进而使细胞进入危机期或者死亡，或者使肿瘤细胞的致瘤性显著下降。LPGENE是一种具有抑制肿瘤细胞的端粒酶活性的蛋白，它是一类新的蛋白质制剂，有重要的应用前景。LPGENE蛋白是由LPTS(Liver putative tumorsuppressor，LPTS)基因编码，该基因是本专利技术人利用定位克隆的方法从人的正常肝cDNA文库中得到的一个肝相关的候选抑癌新基因(C.Liao，M.J.Zhao，H.Song，K.Uchida，K.K.Yokoyama，T.P.Li，Identification of the gene for a novelliver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of heterozygosityregion of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 32(2000)721-727)。该基因编码的蛋白具有抑制细胞端粒酶的活性(Zhou X.Z.，LuK.P..The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor.Cell，2001，107，347-359)。LPTS基因定位于人第8号染色体8p23区段，该区段在多种恶性肿瘤细胞中高频缺失。研究表明，LPTS在肝癌组织及肝癌细胞系中表达量极低或不表达，肿瘤细胞中端粒酶活性的升高，可能与LPTS基因的缺失或表达下调有关。已有文献报道将LPTS基因导入肝癌细胞，能抑制肝癌细胞的生长、增殖、最后引起死亡(Liao C，Zhao MJ，Zhao J，et al.Mutation analysis of novelhuman liver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol，2003，989-93；Zhou X.Z.，Lu K.P..The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor.Cell，2001，107，347-359.)。因此，LPTS蛋白具有抑制肿瘤细胞生长，并导致死亡的作用。中国专利ZL00115395.1公开了LPTS的基因序列和编码蛋白的氨基酸序列。然而，在以往的研究报告中，LPTS蛋白是以GST-融合蛋白或His-融合蛋白的形式在大肠肝菌中重组表达，然后通过GST-或Ni柱亲和层析分离和纯化融合蛋白。然而，亲和层析柱纯化方法生产成本高，根本不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离端粒酶活性抑制剂的方法，其中端粒酶活性抑制剂是ＬＰＴＳ蛋白或其活性片段，其特征在于，该方法包括步骤：（ａ）对含有ＬＰＴＳ蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含所述ＬＰＴＳ蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长ＬＰＴＳ的８０％以上的端粒酶抑制活性；（ｂ）对步骤（ａ）中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的ＬＰＴＳ蛋白或其活性片段。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵慕钧，陈光明，赵静，孙成副，陈国元，李载平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]