血清类粘蛋白抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及特异性识别血清类粘蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为ＣＧＭＣＣ　　ＮＯ．１５１２、ＣＧＭＣＣ　　ＮＯ．１５１３的杂交瘤细胞产生。本发明专利技术还涉及包含上述单克隆抗体的用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，以及血清类粘蛋白抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质工程、基因工程和生物医药领域，具体涉及血清类粘蛋白抗体及其在诊断肿瘤中的用途。
技术介绍
血清类粘蛋白(Orosomucoid，又被称为α1-Acid glycoprotein(AGP))是一种血清糖蛋白，其由183个氨基酸组成，主要合成，分泌于肝细胞。尽管它作为应急蛋白的多种免疫调节功能已经被提出，并作了广泛深入的研究，但其确切的作用至今未知。各种炎症因子和类固醇激素影响AGP mRNA的表达，并且发现在各种炎症状态、肝病、自身免疫性疾病及癌症病人血清中AGP的浓度上升。本领域中还需要找出用于血清学诊断的肿瘤标志物及其相关的诊断试剂和方法。
技术实现思路
为实现上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一对能特异性识别血清类粘蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生。本专利技术另一方面提供了一种用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含一对抗体，由保藏号为CGMCC NO.1512的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第一抗体，以及由保藏号为CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第二抗体。本专利技术另一方面还涉及血清类粘蛋白抗体、尤其是上述单克隆抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。本专利技术的血清类粘蛋白抗体，尤其是本专利技术获得的单克隆抗体能够用于血清学检测各种肿瘤。本专利技术的其它目的和优点可从以下的详细描述中得知。附图说明图1显示了载体pGEX-2T的图谱，图中的Thrombin表示凝血酶；Stop Codons表示终止密码子；glutathione S-transferase表示谷胱甘肽S-转移酶的编码序列；Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。图2显示了重组血清类粘蛋白的SDS-PAGE结果。图3显示了对富集后的血清类粘蛋白用OroD07和OroD09进行Western检测的结果。图4显示了Northern印迹证明血清类粘蛋白在癌症组织样品中上调。具体实施例方式本专利技术者利用含5612个基因的人的cDNA阵列，检测了多对癌症病人及其癌旁正常组织样品的基因表达谱，找到多个在癌症病人中上调的基因，再对这些基因所编码的蛋白进行一，二级结构分析，试图找到含有分泌肽的蛋白。也就是说所找到的蛋白不仅在癌症病人中上调，而且是可以分泌到血清中的。最终发现血清类粘蛋白在多种癌症病人组织样品中上调，且含有分泌肽。这就提示血清类粘蛋白可以作为肿瘤标志物，应用于肿瘤的血清学诊断和病情跟踪。为了验证上面的假设，本专利技术者利用单克隆抗体技术和免疫酶联技术(ELISA)制备并寻找了可配对的针对血清类粘蛋白的单克隆抗体，并利用该配对抗体检测了多种癌症病人和正常人血清中血清类粘蛋白的含量，所得的结果显示血清类粘蛋白可以作为癌症病人的血清学肿瘤标志物，从而完成了本专利技术。本专利技术第一方面提供了两个能特异性识别血清类粘蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体分别由保藏号为CGMCC NO.1512、CGMCC NO.1513的杂交瘤细胞产生。本文所用的术语“抗体”指由至少一个抗体结合位点组成的一个或一组多肽，其具体包括单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性(即与血清类粘蛋白特异性结合)。术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段，每个片段有单个抗原结合部位)，以及一个残余的“Fc”片段(如此称呼是因为它很容易结晶)。用胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段(它具有两个能与抗原交联的抗原结合片段)以及一个残余的其它片段(称为pFc′)。其它片段可包括二抗体、线性抗体、单链抗体分子和抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的，关于抗体的术语“功能性片段”是指Fv，F(ab)和F(ab′)2片段。本文所用的术语“单克隆抗体”指从一群基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规(多克隆)抗体制剂(通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。本文的单克隆抗体还包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)(其中重链和/或轻链的一部分与特定动物种类衍生的、或是属于特定的抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而链的其余部分则与另一动物衍生的、或是属于另一抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源)以及这些抗体的片段，只要这些片段具有所需的生物活性即可。针对血清类粘蛋白的单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用血清类粘蛋白蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。所述血清类粘蛋白蛋白可从商业途径获得，或是根据常规分子克隆和基因重组表达技术来获得。由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。随后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体。用Kohler和Milstein的标准方法或其改进方法可制得单克隆抗体。通常，如上所述对啮齿类动物如小鼠和大鼠进行免疫。当然，也可用家兔、羊或蛙细胞。采用大鼠可能会有某些优点，但是小鼠是较佳的，其中BALB/c小鼠是最佳的，它是最常用的动物，通常能提供较高比例的稳定融合。为了产生单克隆抗体，在免疫接种后，选择具有生产抗体潜力的体细胞，具体是B淋巴细胞(B细胞)，以用于单克隆抗体生产程序。这些细胞可从活检的脾脏、扁桃体或淋巴结、或周围血液样品获得。脾细胞和周围血细胞是较佳的，因为前者是处于分裂的浆母细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，而后者周围血液很容易获得。通常是对一组动物免疫接种，取出抗体滴度最高的动物的脾脏。用注射器将脾脏匀浆，获得脾淋巴细胞。免疫接种过的小鼠的脾脏通常含有约5×107至2×108的淋巴细胞。然后，使免疫接种的动物的产生抗体的B细胞与无限增殖骨髓瘤细胞系(通常与免疫接种动物的种类相同)融合。适用于产生杂交瘤融合程序的骨髓瘤细胞系最好不产生抗体，融合效率较高，且有酶缺陷，使得它们不能在某些只支持所需融合细胞(称为杂交瘤)生长的选择性培养基中生长。可采用许多骨髓瘤细胞中的任何一种，它们是本领域技术人员中已知的。例如，当免疫接种的动物是小鼠时，可采用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp2/0、FO、NSO/U、MPC-11、MPC 11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可采用R210.RCY3、Y3-Ag 1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性识别血清类粘蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为ＣＧＭＣＣＮＯ．１５１２、ＣＧＭＣＣＮＯ．１５１３的杂交瘤细胞产生。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张亮，胡明慧，
申请(专利权)人：中资汉脉北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]