提高蛋白质与聚乙二醇（PEG）结合度的方法技术

本发明专利技术涉及高结合度蛋白以及生成此类蛋白的方法。具体地讲，本发明专利技术涉及使用具有活性的聚乙二醇（ＰＥＧ）连接剂连接蛋白质更多部位（但不使蛋白质变性）的方法。本发明专利技术还涉及免疫原性更弱，循环半衰期更长的高结合度蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白(特别是高结合度蛋白)疗法领域以及生成此类蛋白的方法。
技术介绍
聚乙二醇(PEG)化的蛋白药物已经显示出不可小看的治疗优势，包括血清半衰期的延长和抗原性的降低(Kozlowski，A.，et al.，J.ControlledRelease(2001)72217-224)。PEG的每个环氧乙烷(ethylene oxide)单元与两个或三个水分子结合，因此，从其活动来看，该分子大小似乎是分子量相近的普通蛋白大小的五至十倍(Kozlowski，A.，supra)。聚乙二醇化蛋白的清除率与分子量成反比(Yamaoka，T.，et al.，J.Pharm.Sci.(1994)83601-606)。分子量低于20,000的分子通过尿液清除。具有更高分子量的PEG蛋白通过尿液和粪便以更缓慢的速度清除(Yamaoka，T.，supra)。聚乙二醇化蛋白溶解度更高、抗原性更低、水解稳定性更高，而且其肾清除率得到了降低，肿瘤导向性更强。当前，聚乙二醇化的腺苷脱氨酶、天(门)冬酰胺酶、α-IFN和生长激素拮抗剂已经通过药品注册审批。(Maeda，H.，et al.(eds.)，Advances inexperimental medicine and biologypolymer drugs in the clinical stage，(2003)Vol.519，Dordrecht，The NetherlandsKluwer Academic/Plenum Publishers)。两种PEG-α-IFN被批准用于丙型肝炎治疗。(Kozlowski，A.，supra和Gilbert，C.W，et al.，U.S.patent 5,951,974(1999))。对顽固性或复发性急性淋巴细胞白血病(ALL)患者采用聚乙二醇化天(门)冬酰胺酶与氨甲叶酸、长春新碱和波尼松相结合的方式进行治疗(Aguayo，A.，et al.，Cancer(1999)861203-1209)。研究还表明，PEG-ADA可以显著增强腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症患者的免疫系统，此类病人由于免疫系统的发育受到抑制，几乎对各种传染病都缺乏抵抗力。(Pool，R.，Science(1990)248305；和Hershfield，M.S.，Clin.Immunol.Immunopathol.(1995)76S228-S232)。虽然聚乙二醇化蛋白表现出了理想的治疗特性，但蛋白质上可结合PEG的位点的数目和分布却限制了蛋白质的PEG化。专利技术公开本专利技术涉及高结合度蛋白以及生成此类蛋白的方法。具体来说，本专利技术涉及聚氧亚烷基(polyoxyalkylene)与治疗蛋白的化学偶联方法，该方法可生成免疫原性更低、循环半衰期更长的高结合度蛋白。一方面，本专利技术涉及使用非蛋白聚合链修饰蛋白质的方法，包括a)将蛋白质与非蛋白聚合物偶联，生成初级修饰蛋白，此时该蛋白具有一条或多条非蛋白聚合链；b)将初级修饰蛋白(具有一条或多条非蛋白聚合链)与具有至少两个氨基的多官能氨偶联，生成具有一个或多个附加氨基的修饰蛋白；c)将含有一个或多个附加氨基的修饰蛋白与另一种非蛋白聚合物偶联，生成次级修饰蛋白，它比初级修饰蛋白含有更多的非蛋白聚合链。在一个示例中，使用能与蛋白质的N端氨基反应的官能团，对非蛋白聚合物进行衍生化反应。例如，非蛋白聚合物可与N-羟基丁二酰亚胺进行衍生化反应。在一个示例中，非蛋白聚合物为聚氧亚烷基，例如聚乙二醇。在特殊示例中，官能化的非蛋白聚合物为甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸。通常，非蛋白聚合物的分子量大约为5000。在步骤a)中，初级修饰蛋白可通过蛋白质N端氨基与非蛋白聚合物的酯基偶联来形成。在步骤2中，修饰蛋白(含有一个或多个附加氨基)可通过将初级修饰蛋白的C端羧基与多官能胺中的氨基团相偶联来形成。多官能胺可以是二氨基丁烷。在一个示例中，羧基在催化剂(例如碳二亚胺)存在时，与多官能胺进行偶联。在特殊示例中，羧基在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺存在时与多官能胺偶合。在另一示例中，第二次偶联生成修饰蛋白时，初级修饰蛋白之间没有发生交联。在一个示例中，首次偶联步骤中的蛋白质与非蛋白聚合物的比为1∶15。在另一个示例中，第二次偶联时，初级修饰蛋白与非蛋白聚合物的比为1∶60。本专利技术还提供了根据上述方法修饰的蛋白质。在一个示例中，蛋白质为高结合度蛋氨酶。此外，本专利技术提供了使用聚乙二醇链两次修饰的蛋白质，其中首次修饰是将蛋白质的N端氨基与聚乙二醇酯衍生物偶联，形成初级聚乙二醇化蛋白质，然后将初级聚乙二醇化蛋白的C端羧基与多官能胺(至少含有两个氨基)偶联以形成初级修饰蛋白(含有聚乙二醇链和一个或多个附加氨基)；其中第二次修饰是将次级修饰蛋白的一个或多个附加氨基与其它聚乙二醇酯衍生物偶联，以形成次级修饰蛋白，它含有比初级修饰蛋白更多的聚乙二醇链。本专利技术还提供了包含本专利技术修饰蛋白的医药组合物，以及可接受的制药赋形剂。此外，本专利技术提供了调节肿瘤活动的方法，包括让有此需要的受治者使用有效治疗剂量的本专利技术中提到的修饰蛋白或其医药组合物。受治者可以是人或动物。本文使用的术语“多官能胺”指至少含有一个氨基官能团的胺。在一个示例中，脂肪多官能胺(最好二胺)被用作偶合剂。含有三个或更多氨基官能团的脂肪多官能胺以及芳香多官能胺也拟用作偶合剂。脂肪多官能胺的示例包括但不限于1，4-二氨基丁烷、1，2-二氨基-2-甲基丙烷、1，5-二氨基戊烷、2，2-二甲基-1，3-丙烷二胺、1，6-已烷二胺、二乙烯三胺和三乙烯四胺。在一个示例中，1，4-二氨基丁烷用作偶合剂。芳香族多官能胺的示例包括但不限于p-苯二胺、p-甲代亚苯基二胺和二氨基萘。本文使用的术语“偶合剂”指能在两种反应物之间形成聚合连接的所有物质。在一个示例中，碳二亚胺被用于将氨基与羰基(例如酯或酸)偶联。碳二亚胺的示例包括但不限于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺或N-环己基-N’-(β-乙基)碳二亚胺p-甲苯磺酸盐。在一个示例中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺被用于偶联蛋白质的N端氨基与羰基(例如酯或酸)。本文使用的术语“活化的聚乙二醇”或“活化的PEG”指使用反应活性更强的官能团与聚乙二醇进行衍生反应获得的产物。在特殊示例中，活化的聚乙二醇可以通过使用能够与赖氨酸或蛋白质的N端氨基进行反应的官能团进行衍生反应得到。活化聚乙二醇的方法已为本行业专业人员所熟知。例如，聚乙二醇可以酯化为N-羟基丁二酰亚胺，以形成活化的PEG酯。绘图简要说明附图说明图1描述制备super-PEG-rMETase的方案。图2说明NHS/EDC摩尔比对rMETase的羧基酰胺化程度的影响。图3说明EDC/rMETase摩尔比对rMETase的羧基酰胺化程度的影响。图4说明二氨基丁烷(DAB)/rMETase摩尔比对rMETase的羧基酰胺化程度的影响。图5显示rMETase和聚乙二醇化的rMETases的SDS-PAGE。图6说明rMETase羧基酰胺化期间交联对于初次聚乙二醇化的影响。图7对天然rMETase(◆)、PEG-rMETase本文档来自技高网...

【技术保护点】
使用非蛋白质聚合链修饰蛋白质的方法，包括：　　　　ａ）将蛋白质与非蛋白质聚合物结合，以形成具有一个或多个非蛋白质聚合链的初级修饰蛋白。　　　　ｂ）将上述所得的具有一个或多个非蛋白质聚合链的初级修饰蛋白与至少具有两个氨基基团的多官能胺结合，以形成具有一个或多个附加氨基基团的修饰蛋白质。　　　　ｃ）将上述所得的具有一个或多个附加氨基团的修饰蛋白质与另外的非蛋白质聚合物结合，以形成比初级修饰蛋白质具有更多非蛋白质聚合链的次级修饰蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：李树宽，杨志坚，孙兴华，谭玉英，八木繁雄，
申请(专利权)人：抗癌公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]