一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法技术

本发明专利技术提供了一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法，属于植物倍性育种技术领域。本发明专利技术利用不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植物的叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽利用流式细胞仪进行倍性检测，筛选分离出不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株。本发明专利技术方法解决了木本植物体细胞染色体加倍获得嵌合体的纯化问题，并可快速、高效地构建全同胞或异同胞二倍体、四倍体或其他倍性纯合体的异细胞型植株群体，为开展多倍体育种和倍性效应遗传分析奠定了基础。

A method of separating homozygote from a diploid chimera plant

The invention provides a method for separating homozygote from a ploidy chimera plant, belonging to the technical field of plant ploidy breeding. The invention uses the shoot induction medium for adventitious bud induction on leaf ploidy chimera plants, adventitious buds using flow cytometry ploidy detection on the regeneration of the same individual plants, were isolated in different ploidy homozygote adventitious buds were cultured, obtain homozygote different ploidy. The method of the invention solves the woody plant somatic chromosome purified problem chimera, different cell type plant population and can quickly and efficiently build full sib or different sibling diploid and tetraploid or other ploidy homozygote, which laid the foundation for the development of polyploid breeding and ploidy genetic analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法
本专利技术涉及植物育种
，具体地，涉及一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体以及建立全同胞或异同胞细胞型群体的方法。
技术介绍
多倍体育种是植物遗传改良的重要手段，尤其对于异花授粉的木本植物而言，多倍体育种综合了倍性优势和杂合优势，改良效果显著(康向阳.关于杨树多倍体育种的几点认识.北京林业大学学报,2010,32(5):149-153)。三倍体毛白杨、四倍体刺槐等多倍体品种在生长量、木材品质、代谢产物含量等方面均表现出了显著的优势，已在我国林业生产中广泛应用。四倍体植株通常通过对种子、茎尖等分生组织区施加处理诱导体细胞染色体加倍的途径获取。然而，由于植物分生组织区细胞有丝分裂的不同步性，不同细胞的加倍效果存在差异，往往导致倍性嵌合体的存在，纯四倍体的诱导率较低，影响倍性效应的发挥和育种效率。尽管Wang等通过单细胞合子染色体加倍的方式获得了杨树纯四倍体植株，并避免了嵌合体的产生，但是由于合子休眠期的存在，难以准确把握合子休眠后第一次有丝分裂的时机，因此，合子染色体加倍的四倍体诱导率也仅为3.13％(WangJ,ShiL,SongSY,TianJ,KangXY.TetraploidproductionthroughzygoticchromosomedoublinginPopulus.SilvaFennica,2013,47(2):id932)，而且无法同时获取相同基因型的二倍体细胞型材料。此外，Cai等利用秋水仙碱处理离体培养的叶片，诱导不定芽染色体加倍也获得了杨树四倍体植株(CaiX,KangXY.InvitrotetraploidinductionfromleafexplantsofPopuluspseudo-simoniiKitag.PlantCellReports,2011,30(9):1771-1778)，但是，该方法需将材料进行同步化预培养并掌握合适的处理时机，而且不可避免的也会产生倍性嵌合体植株，同时，大量的工作量仅能完成单个基因型的四倍体诱导，试验操作步骤繁杂，试验周期长，四倍体诱导效率较低，不利于大群体四倍体植株的获得。刘孟军等在田间利用秋水仙碱处理枝条愈伤组织可获得高比率纯四倍体，但是也不能完全避免嵌合体的发生，同时还观察到了八倍体、六倍体、五倍体和三倍体的存在，而且需要经历后期发育过程的形态学鉴定(刘孟军，刘平，王玖瑞，石庆华，徐娟，宁强.枣田间愈伤组织途径免嵌合体纯化快速诱导同源多倍体.园艺学报，2013，40(S):2610)。如能充分利用容易诱导获得的倍性嵌合体为材料，将倍性嵌合体中的四倍体细胞纯化并再生为完整植株，必将极大地提高植物四倍体育种的效率和效果，并且在可能同时纯化出相同基因型的二倍体植株，构建全同胞二倍体和四倍体异细胞型群体，满足深入开展林木倍性效应遗传分析的需要，推动林木遗传改良理论发展。Chen等对黄芪倍性嵌合体材料利用愈伤组织分化并再生的方式，实现了四倍体的纯化，但是由于愈伤组织再生过程非单细胞再生，导致同时产生了嵌合体的植株(ChenLL,GaoSL.InvitrotetraploidinductionandgenerationoftetraploidsfrommixoploidsinAstragalusmembranaceus.ScientiaHorticulturae,2007,112:339-344)。多次继代培养被认为可以实现嵌合体的分离纯化(向素琼，梁国鲁，郭启高，李晓林，何桥.辣木组织培养与四倍体植株诱导.热带亚热带植物学报,2007,15(2):141-146)，但是时间周期很长，而且由于不同倍性细胞发育的竞争性因素，可能导致最终仅能获得二倍体植株，因此，研发更加高效、适宜的嵌合体纯化技术十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前林木四倍体诱导效率低，体细胞染色体加倍易产生倍性嵌合体，难以建立四倍体大群体的问题，提供一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法。本专利技术提供的一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法，根据植物不定芽是单细胞起源(BroertjesC,vanHartenAM.Singlecelloriginofadventitiousbuds[J].Euphytica,1985,34:93-95.)的原理，是利用不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植物的组培苗叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽进行倍性检测，筛选分离出不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株。所述不定芽诱导培养基是经过筛选得到，筛选方法为：将倍性嵌合体植物子代植株的组培苗第2-4片成熟叶片接种于不同配方的诱导培养基上，选择25-40天后叶片分化率高且再生系数高的诱导培养基作为不定芽诱导培养基。本专利技术的方法中，当同一个体植株叶片再生的不定芽长出3-4片真叶后，对单个不定芽采集其不同叶片混合后，使用流式细胞仪对其进行倍性检测，以判断整个不定芽的倍性水平。本专利技术提供了上述方法在植物育种中的应用。本专利技术还提供一种植物全同胞异细胞型群体的构建方法，包括以下步骤：(1)人工控制两种不同植物的雌株和雄株进行杂交；或人工控制两种不同植物的雌株和雄株进行杂交；(2)采集杂交种子进行加倍处理，获得倍性嵌合体植株；(3)以步骤(1)所获得未经加倍处理的种子无菌播种苗为材料，筛选适合步骤(2)的倍性嵌合体植株子代多基因型叶片的不定芽诱导培养基；(4)利用筛选得到的不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植株子代的组培苗叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽进行倍性检测，筛选分离出不同基因型的不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体，进而构建全同胞异细胞型群体。上述构建方法中，步骤(1)控制雌花(或雌株)仅接受目标雄花(或雄株)的花粉，防止外源花粉污染。上述构建方法中，步骤(2)杂交种子进行加倍处理的方法为将授粉后获得的杂交种子无菌处理后，采用0.1-0.3％的秋水仙碱处理1-3天。上述构建方法中，不定芽诱导培养基的筛选方法为：未经加倍处理的种子无菌播种苗第2-4片成熟叶片接种于不同配方的诱导培养基上，选择25-40天后叶片分化率高且再生系数高的诱导培养基作为不定芽诱导培养基。本专利技术进一步提供了上述构建方法在植物加倍育种中的应用，该方法能快速、高效地创建林木全同胞二倍体和四倍体异细胞型群体，为林木多倍体遗传改良和倍性效应遗传分析等研究提供材料。在本专利技术的一个实施例中，使用小青杨雌株和钻天杨雄株进行授粉杂交，分别于授粉后37、40、43天采集杂交种子，分别用0.1％、0.2％、0.3％的秋水仙碱处理获得的杂交种子1、2、3天，用流式细胞仪检测后确定诱变植株的倍性，发现在授粉后第43天，用0.1％秋水仙碱处理24小时，小青杨×钻天杨种子存活率83.33％，获得的嵌合体数量最多，达15株。选择未经秋水仙碱加倍处理的种子无菌播种生长40天的组培苗第2-4片成熟叶片，过叶片主脉将其剪成1cm左右长，叶面向下接种于含细胞分裂素6-BA(0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L)和生长素NAA(0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)的MS固体培养基上，30天后统计叶片分化情况。发现适本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法，其特征在于，利用不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植物的组培苗叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽进行倍性检测，筛选分离出不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株。

【技术特征摘要】
1.一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法，其特征在于，利用不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植物的组培苗叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽进行倍性检测，筛选分离出不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养基是经过筛选得到，筛选方法为：将倍性嵌合体植物子代植株的组培苗第2-4片成熟叶片接种于不同配方的诱导培养基上，选择25-40天后叶片分化率高且再生系数高的诱导培养基作为不定芽诱导培养基。3.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，当同一个体植株叶片再生的不定芽长出3-4片真叶后，对单个不定芽采集其不同叶片混合后，使用流式细胞仪对其进行倍性检测，以判断整个不定芽的倍性水平。4.权利要求1-3任一所述的方法在植物育种中的应用。5.一种植物全同胞异细胞型群体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人工控制两种不同植物的雌花和雄花进行杂交，或人工控制两种不同植物的雌株和雄株进行杂交；(2)采集杂交种子进行加倍处理，获得倍性嵌合体植株；(3)以步骤(1)所获得未经加倍处理的种子无...

【专利技术属性】
技术研发人员：王君，宋少宇，李代丽，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11