表达抑制昆虫保幼激素结合蛋白基因的dsRNA的重组杆状病毒制造技术

本发明专利技术公开了一种表达抑制昆虫保幼激素结合蛋白基因（HaJHBP基因）的dsRNA的重组杆状病毒及其在制备杀虫剂中的应用。本发明专利技术提供了一种RNA分子，为如下（a）或（b）：（a）序列表的序列7所示的RNA分子；（b）与序列表的序列7反向互补的RNA分子。编码所述RNA分子的DNA分子也属于本发明专利技术的保护范围。含有所述DNA分子的重组载体、重组杆状病毒、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明专利技术的保护范围。本发明专利技术将棉铃虫作为模式昆虫，通过抑制保幼激素结合蛋白基因在昆虫体内的表达，可以促进杆状病毒对昆虫的杀虫效力，从而达到控制害虫对农作物危害的目的。本发明专利技术对于农业生产具有重大价值。

Recombinant baculovirus expressing dsRNA inhibiting insect hormone binding protein gene

The invention discloses a recombinant baculovirus expressing the dsRNA inhibiting the juvenile hormone binding protein gene (HaJHBP gene) and its application in the preparation of insecticides. The present invention provides a RNA molecule for the following (a) or (b): (a) sequence of RNA molecules shown in sequence 7; (b) reverse complementary RNA molecules with sequence 7 of a sequence table. The DNA molecules encoding the RNA molecules also belong to the scope of protection of the present invention. A recombinant vector containing the DNA molecule, a recombinant baculovirus, an expression cassette, a transgenic cell line or a recombinant bacterium belong to the scope of protection of the present invention. The invention of cotton bollworm as a model insect, through inhibition of juvenile hormone binding protein gene expression in insect baculovirus insecticide, can promote to insect pest control effect, so as to achieve the purpose of harm to crops. The invention is of great value for agricultural production.

【技术实现步骤摘要】
表达抑制昆虫保幼激素结合蛋白基因的dsRNA的重组杆状病毒
本专利技术涉及一种表达抑制昆虫保幼激素结合蛋白基因的dsRNA的重组杆状病毒及其在制备杀虫剂中的应用。
技术介绍
昆虫的蜕皮和变态是复杂、高度保守又受到精密调控的过程，这一过程主要受20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)和倍半萜类保幼激素(juvenilehormone,JH)的共同调控。JH合成后进入血液，与血液中的保幼激素结合蛋白（JHbindingprotein，JHBP）结合，形成复合物随血液循环进入到靶细胞。JHBP的功能如下：1、转运JH至靶细胞；2、阻止JH与其它蛋白质非特异性结合，保持活性；3、阻止JH被分解。昆虫激素已作为新一代杀虫剂，于其选择性极强，对高等动物无致畸、致癌、致突变作用，对哺乳动物、鸟类等十分安全，有非常广阔的应用前景。激素合成和代谢途径中的基因，作为具有潜在抗虫性的基因引起了我们的兴趣。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种新发现的基因调控机制，是由与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。RNAi在功能基因组学、药物靶位点筛选、细胞信号传导通路分析、疾病治疗等方面都有广泛的应用潜力。杆状病毒(baculovirus)是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，基因组大小为80-180kb。杆状病毒的结构特征为病毒粒子呈杆状，外面包被着一层蛋白质膜，外观有一定规则，称为多角体病毒（NPV）。杆状病毒专一感染节肢动物，其自然宿主主要为鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫，还感染一些甲壳类和螨类。在自然界中，杆状病毒存在出芽病毒粒子(buddedvirus,BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derivedvirus,ODV；又称多角体包涵体，简称PIB或OBs)两种病毒形式。BV是在昆虫细胞之间传播的一种病毒粒子，带有病毒编码的囊膜蛋白，可以与细胞表面的特定受体相结合，在昆虫体内或者细胞系的细胞之间传播。ODV是杆状病毒在环境中的传播形态，包埋于包涵体中。包涵体由多角体蛋白质组成，其外侧为多角体囊膜，在环境中非常稳定，对病毒粒子起到保护作用。未经感染的幼虫吞下含多角体包涵体的食物后，多角体蛋白在昆虫中肠中的酸性pH环境下降解，释放病毒粒子核衣壳，病毒接触并感染昆虫幼虫中肠的表皮细胞组织，制造出芽病毒粒子，芽病毒粒子通过出芽经细胞质膜进入宿主昆虫的血腔中，导致系统感染，在杆状病毒感染后期，病毒粒子被大量多角体蛋白包被，形成多角体包涵体。杆状病毒对宿主昆虫有较高的致病性，对天敌安全，不污染环境，尤其是它能在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口并且不产生抗药性，明显优于其它杀虫剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种表达抑制昆虫保幼激素结合蛋白基因（HaJHBP基因）的dsRNA的重组杆状病毒及其在制备杀虫剂中的应用。本专利技术提供了一种RNA分子，为如下（a）或（b）：（a）序列表的序列7所示的RNA分子（单链RNA分子或双链RNA分子）；（b）与序列表的序列7反向互补的RNA分子（单链RNA分子或双链RNA分子）。编码所述RNA分子的DNA分子也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子为如下1）或2）或3）：1）依次由DNA片段Ⅰ、间隔区和DNA片段Ⅱ组成的DNA分子；所述DNA片段Ⅰ如序列表的序列6自5’末端第1至483位核苷酸所示；所述DNA片段Ⅱ如序列表的序列6自5’末端第697至1179位核苷酸所示；2）序列表的序列6所示的DNA分子；3）序列表的序列2自5’末端第207至689位核苷酸所示的DNA分子。含有所述DNA分子的重组载体、重组杆状病毒、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述重组载体中，可由op166启动子（杆状病毒早期启动子）和/或P10启动子（杆状病毒晚期启动子）启动所述DNA分子的表达。所述op166启动子具体如序列表的序列5所示。所述P10启动子具体如序列表的序列8所示。所述重组载体可具有表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲为用于表达所述DNA分子的表达盒；所述表达盒乙为用于表达杆状病毒多角体蛋白（Hapolh蛋白）的编码基因的表达盒。所述重组载体具体可为将所述op166启动子、所述DNA分子和所述多角体蛋白的编码基因分别插入表达载体（如载体pFastBacTMDUAL）的多克隆位点得到的重组质粒M。所述op166启动子可插入载体pFastBacTMDUAL的NcoI和SmaI酶切位点之间。所述所述DNA分子可插入pFastBacTMDUAL的PvuII酶切位点。所述多角体蛋白的编码基因可插入载体pFastBacTMDUAL的BamHI和HindIII位点之间。所示重组载体具体可为将所述表达盒甲和所述表达盒乙插入Hz8⊿egtBacmid中的attB位点得到的重组质粒N。所述重组载体具体可为将所述重组质粒M中Tn7L和Tn7R位点之间包括所述表达盒甲和所述表达盒乙在内的DNA片段插入Hz8⊿egtBacmid中的attB位点得到的重组质粒Q。所述Hz8⊿egtBacmid为将HaBacHZ8Bacmid中的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶基因（又称EcdysteroidUDP-Glucosyltransferase基因，简称egt基因)灭活后得到的重组质粒。所述Hz8⊿egtBacmid具体为将序列表的序列9所示的egfp基因取代HaBacHZ8Bacmid中的egt基因的开放阅读框自5’末端116至1470位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。所述重组杆状病毒可为出芽病毒粒子的形式或多角体包涵体的形式（多角体包涵体与出芽病毒粒子相比，具有口服感染的能力）。所述重组杆状病毒的出芽病毒粒子具体可通过如下方法制备得到：将所述重组质粒N或所述重组质粒Q导入昆虫细胞（如棉铃虫HzAm1细胞）并进行培养，收集培养上清，即为含有所述出芽病毒粒子的病毒液。所述重组杆状病毒的多角体包涵体可通过如下方法制备得到：将所述重组质粒N或所述重组质粒Q导入昆虫细胞（如棉铃虫HzAm1细胞）并进行培养，收集细胞沉淀，细胞沉淀中即含有所述多角体包涵体。所述重组杆状病毒的多角体包涵体可通过将所述出芽病毒粒子接种昆虫并收集昆虫尸体得到。所述重组杆状病毒的多角体包涵体具体可通过如下方法制备得到：将所述出芽病毒粒子接种昆虫，昆虫死亡后收集尸体并捣碎，加入水并搅匀后用纱布过滤，收集滤液并300g离心10min，收取上清液并3000g离心30min，收集沉淀，即为所述多角体包涵体。所述昆虫可为棉铃虫。以上任一所述杆状病毒多角体蛋白为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多角体蛋白功能的的由序列3衍生的蛋白质。以上任一所述杆状病毒多角体蛋白的编码基因可为如下4）或5）或6）或7）的DNA分子：4）序列表的序列4自5’末端第157-897位核苷酸所示的DNA分子；5）序列表中序列4所示的DNA分子；6）在严格条件下与4）或5）限定的DNA序列杂交且编码多角体蛋白的DNA分子；7）与4）或5）限定的DNA序列具有90%以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有目的DNA分子的重组载体，其特征在于：所述重组载体中具有表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲为用于目的DNA分子的表达盒；所述表达盒乙为用于表达杆状病毒多角体蛋白的编码基因的表达盒；所述表达盒甲中，由op166启动子和/或P10启动子启动目的DNA分子的表达；所述目的DNA分子为如下1)或2)：1)依次由DNA片段Ⅰ、间隔区和DNA片段Ⅱ组成的DNA分子；所述DNA片段Ⅰ如序列表的序列6自5’末端第1至483位核苷酸所示；所述DNA片段Ⅱ如序列表的序列6自5’末端第697至1179位核苷酸所示；2)序列表的序列6所示的DNA分子；所述重组载体是通过将所述表达盒甲和所述表达盒乙插入Hz8⊿egt Bacmid中的attB位点得到的；所述Hz8⊿egt Bacmid为将HaBacHZ8Bacmid中的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶基因灭活后得到的重组质粒；所述杆状病毒多角体蛋白由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
1.一种含有目的DNA分子的重组载体，其特征在于：所述重组载体中具有表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲为用于目的DNA分子的表达盒；所述表达盒乙为用于表达杆状病毒多角体蛋白的编码基因的表达盒；所述表达盒甲中，由op166启动子和/或P10启动子启动目的DNA分子的表达；所述目的DNA分子为如下1)或2)：1)依次由DNA片段Ⅰ、间隔区和DNA片段Ⅱ组成的DNA分子；所述DNA片段Ⅰ如序列表的序列6自5’末端第1至483位核苷酸所示；所述DNA片段Ⅱ如序列表的序列6自5’末端第697至1179位核苷酸所示；2)序列表的序列6所示的DNA分子；所述重组载体是通过将所述表达盒甲和所述表达盒乙插入Hz8⊿egtBacmid中的attB位点得到的；所述Hz8⊿egtBacmid为将HaBacHZ8Bacmid中的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶基因灭活后得到的重组质粒；所述杆状病毒多角体蛋白由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述目的DNA分子编码一种RNA分子；所述RNA分子，为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列7所示的RNA分子；(b)与序列表的序列7反向互补的RNA分子。3.一种含有目的DNA分子重组杆状病毒，其特征在于：所述目的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱祯，王晓芳，魏晓丽，张磊，戴艳，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11