本发明专利技术涉及用于生产抗－ＲｈＤ重组多克隆抗体组合物（抗－ＲｈＤｒｐＡｂ）的方法所述方法包括获得用抗－ＲｈＤ抗体表达载体转染的细胞的集合，其中在所述集合中的每个细胞能从包含Ｖ↓［Ｈ］和Ｖ↓［Ｌ］的核酸片段表达文库的一个成员，所述的文库成员编码抗－ＲｈＤ重组多克隆抗体组合物的一个独特成员并且其位于所述集合中的单独细胞的基因组中的相同位点。将所述细胞在适合表达所述重组多克隆抗体的条件下培养，所述抗体从细胞或培养物上清液获得。通过用用于位点特异性整合的载体文库转染细胞而将编码抗－ＲｈＤ ｒｐＡｂ的核酸片段导入所述细胞中。本方法适于生产抗－ＲｈＤ ｒｐＡｂ，因而可以得到优于血浆来源的预防性和治疗性免疫球蛋白产物的替代品。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术描述了抗-恒河猴D重组多克隆抗体(抗-RhD rpAb)的产生以及产生多克隆工作细胞库的方法，所述的细胞库用于随后产生期望的多克隆抗体。本专利技术也涉及编码抗-RhD rpAb的文库并涉及产生抗-RhD rpAb的细胞系。此外，本申请案描述了包含抗-RhD rpAb的药理学和诊断性组合物以及它们在预防新生儿溶血性疾病(HDN)、治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)和防止在错误地将RhD(+)血输入至RhD(-)个体后对恒河猴D抗原的致敏作用的用途。
技术介绍
恒河猴血液群抗原位于跨膜红血球蛋白，该跨膜红血球蛋白包含所谓的C、c、E、e和D抗原。由于遗传的多态性，大约16％的白种人为恒河猴D阴性(RhD(-))。而且，存在多种RhD的遗传和血清学变体(分为类型II-VII)，其中RhDVI是与临床最相关的。因为VI型阳性红细胞(RBC)比其它类型的RBC携带较少的多种D蛋白表位，RhDVI(+)个体可以形成对抗来自其它RhD阳性(RhD(+))个体的RBC的同种抗体(Issitt，P.D.和Anstee，D.J.，1998.The Rh Blood GroupSystem，Montgomery Scientific Publications，Durham，NorthCarolina，pp.315-423)。{Issitt&Anstee 1998 11809/id}RhD阴性本身不与任何医学情况相关，但当RhD(-)母体孕有RhD(+)或RhDVI(+)胎儿或RhDVI(+)母体孕有RhD(+)胎儿时具有重要的医学关联。如果婴儿的红细胞进入母体的循环系统中，通常是在围产期(在分娩时)，则可能发生母婴的RhD异源免疫，并因而引起母体抗-RhD抗体应答的诱导。在后来的妊娠中，母体的RhD-特异性IgG-分子将通过胎盘进入至胎儿的循环中并介导胎儿红细胞的溶解，因而引起新生儿溶血性疾病(HDN)。据估计，平均20％第二次分娩RhD(+)婴儿，并且没有进行适当的抗-D预防的RhD(-)妇女，将产生抗-RhD抗体反应。当未处理时，大约30％的新生儿将患有中度的贫血症、黄疸和肝肿大，并且20％发展为严重贫血症和胎儿水肿，并且严重受影响的新生儿有新生儿死亡或永久性严重残疾的危险。对抗RhD的多克隆免疫球蛋白制剂在世界范围内用于预防怀孕的RhD(-)和RhDVI(+)妇女的异源免疫，因而防止新生儿的溶血性疾病。对抗RhD(抗-D)的多克隆免疫球蛋白制剂目前通过采集血浆获得，所述的血浆从已经变得超免疫的供体获得，其中超免疫是通过自然RhD异源免疫或通过用RhD阳性红细胞接种RhD阴性自愿者而获得的。用于预防HDN的抗-RhD免疫球蛋白制剂的效力是相当确定的并已经常规使用许多年。因而这种严重的疾病已经稀有发生。然而，这种疾病的根本起因，即怀孕的RhD(-)和RhDVI(+)妇女的异源免疫，仍然存在并因而需要不断的供应抗-D免疫球蛋白制剂。除了预防HDN，抗-D免疫球蛋白也已证明可用于治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)(George，J.N.，2002.Blood Rev.16，37-38)。ITP是血液疾病，其中自身抗体导致脾和肝中加速的血小板清除率。症状是血小板水平降低，导致瘀伤和流血。严重的情况时要将脾脏移除。然而由于严重的副作用这在婴儿中是不可能的，因而需要备选的治疗，如抗-D免疫球蛋白。而且，在错误地将RhD(+)血液输注给RhD(-)受血者后使用抗-D免疫球蛋白以便防止对恒河猴D抗原的致敏作用。目前用于产生抗-D的方法，正如已经提到的，需要重复免疫日益难得到的一群供体用于产生高滴度抗血清。也存在相关的风险因素和技术问题，例如用于免疫的恒河猴阳性RBC的使用带有传播病毒病(例如乙型肝炎病毒、AIDS以及其它仍未知的病毒)的风险。而且，也存在批与批之间变化的问题。因而，需要一种备选的用于产生抗-RhD抗体的方法。首先发展了用于产生抗-RhD单克隆抗体的细胞方法作为超免疫血清的备选。这种技术包括用EB病毒转化产生B类淋巴母细胞系的淋巴细胞(Crawford等1983.Lancet 1，386-8)。然而，这些细胞系不稳定并需要大量的克隆。通过杂交瘤技术产生人抗体也受限于缺少合适的人骨髓瘤融合伴侣(Kozbor，D.和Roder，J.C，1983.Immunol.Today.4，72)。作为这些技术的替代，发展了涉及VH和VL的全套克隆和噬菌体展示文库的构建的分子方法(Barbas，CF.等，1991.Proc Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982)。噬菌体展示技术也可应用于分离恒河猴D抗原结合物。已经用这种方法分离了大量具有恒河猴D抗原结合特异性的单克隆抗体(mAbs)(WO 97/49809和Siegel，D.L等，2002.Transfus.Clin.Biol.9，83-97)。最近使用重组抗-RhDVImAb的临床试验已经显示，有可能在用RhD(+)RBC大量攻击后防止RhD免疫反应(Miescher，S.等，2004，Blood 103，4028-4035)。然而，该试验也显示，该mAb在有关RBC清除率上比抗-D免疫球蛋白效力低。这种降低的清除率的原因仍然未知。有可能是，一种单一抗体不能像抗-D免疫球蛋白产品中存在的抗体的多样性一样有效，或者是有可能多于一种免疫球蛋白同种型即IgG1和IgG3的存在{Siegel，Czerwinski等，2002 10320/id}增加了RBC清除率。除了效力的问题，有关HDN预防的另一问题是其中RhDVI(+)母体孕有RhD(+)婴儿的情况。在这种情况下，抗-RhDVImAb将不能防止母体的异源免疫。因而，为了保护RhD(-)和RhDVI(+)母体，需要具有对抗恒河猴D VI型抗原的抗体以及具有不结合VI型抗原而是其它一般的恒河猴D抗原的抗体的产品。mAb的另一可能的问题是它们可能是免疫原性的。尽管mAb是人的，第一次治疗可能在用该mAb治疗的母体中导致抗体反应。理论上，因为该mAB的CDR区(该区之前从未被受治的个体的免疫系统见过)如果以足够大的剂量存在可能会被识别为外源物质，这是可能发生的。这种反应使该抗-RhD mAb失效，除非重复进行预防性治疗。通过混合单克隆抗体而克服使用mAb的一些潜在问题是可能的。然而，这将意味着单独产生和纯化未确定数量的抗体，这将是十分费钱的。而且，这种混合物的单独单克隆抗体的不同批次的性质可能影响最终的产品。本申请公开内容本专利技术提供了用于产生生产型细胞系的方法，所述的细胞系可以单批次表达抗-RhD重组多克隆抗体(抗-RhD rpAb)。专利技术描述本专利技术提供了用于一致性地生产抗-RhD重组多克隆抗体(抗-RhDrpAb)的方法。期望本专利技术将开拓大规模生产和产生一类新的预防和治疗性抗-RhD抗体产品的可能性。本专利技术的抗-RhD rpAb潜在地具有一些优于单克隆抗-恒河猴D抗体的优势。首先，每种潜在的恒河猴D表位将由多于一种的抗体覆盖，因而抗-RhD rpAb组合物可用于预防性治疗孕有RhD(+)婴儿的RhD(-)和RhDVI母体。因而，将不必混合来自不同生产和纯化批次的mAb以便获得完全本文档来自技高网...
【技术保护点】
产生细胞集合的方法，所述细胞适于作为用于表达抗－ＲｈＤ重组多克隆抗体的生产型细胞系，所述的方法包括 ａ）提供了抗－ＲｈＤ抗体表达载体文库，其中所述文库的每个单独载体包括：１）单拷贝的编码抗－ＲｈＤ多克隆抗体的独特成员的核酸片段和２）一个或多个重组酶识别序列； ｂ）将所述的抗－ＲｈＤ抗体表达载体文库导入宿主细胞系，其中所述宿主细胞系的各单个细胞的基因组包含重组酶识别序列，所述的识别序列在其基因组中与载体上的重组酶识别序列匹配； ｃ）确保在所述细胞中存在一个或多个重组酶，以使步骤（ａ）中的编码抗－ＲｈＤ抗体的核酸片段位点特异性地整合进宿主细胞系的细胞中，其中所述的重组酶是ｉ）由导入了所述核酸序列的所述细胞表达的；ｉｉ）由步骤（ａ）中的载体有效编码；ｉｉｉ）通过第二载体表达而提供；或ｉｖ）作为蛋白质提供给所述细胞；和 ｄ）选择细胞，所述的细胞含有来自所述抗－ＲｈＤ抗体表达载体文库的整合的编码抗－ＲｈＤ抗体的核酸片段的拷贝。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：SK拉斯姆森，AB托尔斯特鲁普，SB弗雷德里克森，J豪拉姆，
申请(专利权)人：西福根有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]
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