用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，包括的步骤如下：(1)抗原的制备：将半乳糖凝集素‑3、转甲状腺素蛋白、癌抗原‑125和人附睾蛋白4基因制得所需的抗原；(2)捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体；(3)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体；(4)捕获抗体包被；(5)封闭和加样。本发明专利技术的有益效果如下：最全面的检测卵巢癌，能够更好的判断绝经前或绝经后盆腔肿块的良恶性，更好地对妇科良性卵巢肿块和囊肿与卵巢癌进行鉴别诊断，具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到96％以上。

Preparation method of early and middle term rapid diagnostic kit for ovarian cancer

The invention discloses a preparation method for early stage ovarian cancer rapid diagnostic kit, including the following steps: (1) antigen preparation: galectin 3, transthyretin, cancer antigen 125 and human epididymis protein 4 gene was required for antigen (2); the capture antibody preparation: the antigen mammal has corresponding monoclonal antibody; (3) the detection of antibody preparation: the mammalian immune antigen polyclonal antibody was obtained accordingly; (4) capture antibody; (5) closed and sample. The invention has the advantages that: the most comprehensive detection of ovarian cancer, can better judge the menopause before or after menopause of pelvic tumors, better for the differential diagnosis of benign ovarian masses and cysts and ovarian cancer has the characteristics of high sensitivity, high accuracy, sensitivity and accuracy were above 96%.

【技术实现步骤摘要】
用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法
：本专利技术涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法。
技术介绍
：卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，是指生长在卵巢上的恶性肿瘤，其中90％～95％为卵巢原发性的癌。就诊时60％～70％已为晚期，而晚期病例又疗效不佳。因此，虽然卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难，所以卵巢癌无论在诊断和治疗上确是一大难题。到目前为止，就国内外临床资料统计，其五年生存率仅25％左右。但是如果发现得早，90％的病人都能活下来；卵巢癌5年内的复发率可高达80％，且复发时间主要集中在治疗期的3年内。在女性的一生中，每五位女性就会有一位出现盆腔肿块，需要接受检查来排除恶性肿瘤的可能性。目前，卵巢癌的诊断主要依据两种检测手段。一种是经阴道超声检查(TUV)。这种成像方法可用于检查女性的生殖器官，包括子宫、卵巢、宫颈及阴道。尽管其应用较为普遍，但是这种方法并不能准确检测出该肿块是良性还是恶性。此外，该方法还需要经验丰富的临床技师对检测结果进行解读。另一种常规检测方法是检测肿瘤标志物CA125，这种方法被视为卵巢癌诊断的“金标准”。但是，CA125的特异性及敏感度较低，容易出现假阴性或假阳性。大约50％的卵巢癌I期患者并没有CA125水平升高的现象，也就是说有一半的卵巢癌患者可能被漏诊。某些良性卵巢疾病也会导致CA125水平升高，造成假阳性。因此，在临床诊断上亟需一种更好的诊断工具以尽早诊断卵巢癌。肿瘤标志物(tumormarkers，TM)是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的标志肿瘤存在和生长的一类物质。这些物质在正常成人中不存在或者是在癌症患者中出现的水平显著高于正常人。目前肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途径，这一检测技术可先于X光片、超声、CT、MRI或PET-CT等物理检查发现肿瘤。可用于高危人群恶性肿瘤的筛查，肿瘤诊断与鉴别诊断，评估治疗的效果，预测或监视肿瘤复发或转移。目前，医院出现的卵巢癌诊断试剂盒是检测常见的肿瘤标记物，灵敏性及准确性都偏低，即使联检也只70％左右，难以满足早期快速诊断的要求。由于市场上还没有针对卵巢癌的快速高效诊断试剂盒问世，严重影响到卵巢癌早期发现及治疗，卵巢癌患者确诊时往往已处于癌症晚期，错过了最佳治疗时机，大大降低了患者的生存率。如果卵巢癌能被早期诊断，可以极大地提高患者的生存率。
技术实现思路
：本专利技术的目的是针对以上述卵巢癌诊断存在的不足，提供一种灵敏度高,准确性强的用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术采取的技术方案是：用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体包括半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(TTR)和癌抗原-125(CA-125)分别制得的单克隆抗体。所述捕获抗体还包括人附睾蛋白4(HE4)制得的单克隆抗体。所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体包括半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睾蛋白4(HE4)分别制得的多克隆抗体。所述捕获抗体为将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睾蛋白4(HE4)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下：(1)抗原的制备：把半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睾蛋白4(HE4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；(2)捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。所述检测抗体为将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睾蛋白4(HE4)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下：(1)抗原的制备：把半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睾蛋白4(HE4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；(2)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：(1)抗原的制备：将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睾蛋白4(HE4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；(2)捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；(3)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；(4)捕获抗体包被：①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST(磷酸盐吐温缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用。(5)封闭和加样：每孔添加200μl封闭缓冲液(1.2％BSA/PBS)，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。本专利技术方法可以提高用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到96％以上。用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：(1)抗原的制备：将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睾蛋白4(HE4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；(2)捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；(3)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；(4)捕获抗体包被：①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST(磷酸盐吐温缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于.包括的步骤如下：(1)抗原的制备：将半乳糖凝集素‑3、转甲状腺素蛋白、癌抗原‑125和人附睾蛋白4基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；(2)捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体；(3)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体；(4)捕获抗体包被：①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；③.弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μl PBST，除去洗涤液，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；(5)封闭和加样：每孔添加200μl封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点，用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃下孵育至少1小时，所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下：(1)抗原的制备：通过分子克隆的方法把半乳糖凝集素‑3、转甲状腺素蛋白、癌抗原‑125和人附睾蛋白4基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原；(2)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。...

【技术特征摘要】
1.用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于.包括的步骤如下：(1)抗原的制备：将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白、癌抗原-125和人附睾蛋白4基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；(2)捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体；(3)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体；(4)捕获抗体包被：①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；③.弃去包被液，并用洗涤液洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：余跃飞，罗喜平，王晓娟，
申请(专利权)人：广州恒泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44