一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列技术

本发明专利技术涉及生物基因工程技术领域，具体的说是一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列。基因序列包括SEQID NO:1所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因。具体方法通过电穿孔法将包括SEQ ID NO:1所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因的叶绿体转化载体导入微拟球藻细胞。本发明专利技术提供了根据七株微拟球藻叶绿体基因组之间的保守基因以及微拟球藻叶绿体和硅藻或褐藻叶绿体基因组的保守基因，可以用于设计构建在微拟球藻中通用的叶绿体遗传改造体系以及多个种属单细胞微藻通用的叶绿体遗传改造体系。

A method of Nannochloropsis salina chloroplast exogenous DNA and chloroplast genome sequence correlation

The invention relates to the technical field of gene engineering, in particular to a method of Nannochloropsis salina chloroplast exogenous DNA and chloroplast genome sequence correlation. The gene sequence includes exogenous gene sequence between SEQID shown in the NO:1 sequence, SEQ ID NO:2 shown and insert two. The specific method by electroporation will include exogenous gene sequence between SEQ ID shown in the NO:1 sequence, SEQ ID NO:2 shown and insert both the chloroplast transformation vector into Nannochloropsis oculata cells. The present invention provides according to the seven strains of micro quasiconservative gene between the chloroplast genome of Synechococcus and conserved genes of Nannochloropsis salina chloroplast and chloroplast genome of diatoms or brown algae, can be used to design the building in Nannochloropsis oculata in general and a plurality of chloroplast genetic transformation system of species of unicellular microalgae universal chloroplast genetic transformation system.

【技术实现步骤摘要】
一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列
本专利技术涉及生物基因工程
，具体的说是一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列。技术背景能源和资源短缺已经成为制约我国经济持续发展、影响我国国家安全的重大战略问题。基于生物催化剂清洁、高效、可再生等特点，生物制造可以大大减少工业发展对化石资源依赖，减少能耗、物耗、水耗和废弃物排放，显著提高经济效益，增强市场竞争力。与石化路线相比，生物制造可以平均节能30-50%，减少人类对环境的影响达20-60%。太阳光是地球上最充足的清洁能源。光合作用是唯一能捕捉太阳能的生物途径,还可以固定二氧化碳，因此是实现利用太阳能与大幅减排CO2进行清洁能源生产的有效途径。微藻是最有潜力实现现实意义上的光能整合生物制造的细胞工厂之一，其优势在于：第一、高效光能转化生物质：微藻（包括原核蓝藻和真核藻类），和绿色高等植物一样，有比较完整的光合作用系统。微藻的理论光合作用效率最高可达10%。相比而言，陆生作物一般仅能将0.1~0.7%（C3作物）或1.5~2.5%（C4作物）的太阳能转化为生物质。可见，微藻作为光能整合生物加工细胞工厂的优势远大于陆生植物。此外，一些微藻具备出色的环境耐受能力，可以在淡水、海水、生活废水、工业废水中生长；在通入烟道气时强劲生长，能够室外规模培养。第二、高效CO2固定：微藻遍布于地球海洋、河流和湖泊等淡水和海洋水体中以及各种土壤（包括酷暑和寒冷的荒芜环境）里，甚至人迹罕至的南北极等极端环境中。每年由微藻光合作用固定的二氧化碳占全球二氧化碳固定量的40%以上，在能量转化和碳元素循环中起到重要的作用。大规模微藻培养有望实现工业化方式固定太阳能和大幅度减排CO2，提供低碳的清洁能源。第三、高效积累高能量密度、高附加值产物：微藻代谢途径丰富，以微拟球藻为例，它不仅可以在静止状态下大量积累油脂（甘油三酯，即生物柴油），还可以积累微藻蛋白（藻蓝蛋白、饲料蛋白、必需氨基酸）、长链多不饱和脂肪酸（AA、EPA、DHA）、多种色素（虾青素、胡萝卜素、叶黄素）等高附加值产物，可以用于开发颜料、肥料、土壤调节剂、抗氧剂、食品添加剂、化妆品。海洋微拟球藻（Nannochloropsissp.)，是一种海洋单细胞微藻，在分类学上归属于褐藻门(Phaeophyta)，大眼藻纲(Eustigmatophyceae)，单珠藻科（Monodopsidaceae）。微拟球藻直径2-5μm，无组织分化，生态分布广泛；具有丰富的在藏藻株资源；进化地位独特，是单细胞微藻中独立的一个属。有研究比较了31种微藻的生物量、脂质含量及产量，其中海洋微藻Nannochloropsis的脂质产量排在第一位（表1）。已发现许多株Nannochloropsis都具有1）生长迅速；2）在高光强或营养缺失条件下积累大量三脂酰甘油（TAG）等优点。此外，在一些大型（如美国Solix公司）和半工业规模（亚利桑那州立大学、中国科学院青岛生物能源与过程研究所）室外培养中发现，当通入烟道气时，Nannochloropsis（如Nannochloropsissalina和NannochloropsisoculataOZ-1）能强劲生长，且能在生长静止期积累大量的油脂，具备大规模工业化培养的潜力。此外，微拟球藻藻体微小，富含碳水化合物、蛋白质和多不饱和脂肪酸，已被作为优良饵料大量应用于水产养殖；微拟球藻还含有多种经济价值较高的色素，如玉米黄素、斑蝥黄素和虾青素等。可见，微拟球藻作为功能基因组学研究和商业化应用具有明显的优势。表1代表性藻种生物量积累、油脂含量和油脂产量尽管微拟球藻用于光能整合生物加工的优势明显，但其经济可行性仍面临着巨大挑战，主要的技术瓶颈包括微藻生长密度低，且仅在环境胁迫条件下积累油脂等。其在正常生理状态下，积累长链（C16和C18）和极长链（C20、C22、C24和C26）脂肪酸，中短链脂肪酸含量低，造成其生产的生物柴油浊点高、易氧化，且长链脂肪酸的积累对微藻中性脂合成产生抑制，这些因素都成为制约微拟球藻用于光能整合生物生产的关键瓶颈。另一方面，随着微藻生物技术的发展，微拟球藻用于构建高效微藻反应器（生产高值蛋白、油脂、色素、抗菌肽）、开发口服型渔药等方面具有独特优势。然而，微拟球藻基因工程的缺失，严重制约了微拟球藻作为生物反应器在实践中的应用。在能进行光合作用的真核细胞中，细胞核、叶绿体和线粒体三种细胞器各含有一套DNA分子，构成了既独立又相互联系的遗传体系。自20世纪70年代基因工程技术诞生以来，向细胞核导入外源基因的转化技术已经得到普遍应用。然而随着研究的深入发展，人们逐渐认识到核基因组中的基因工程操作有着如下难以克服的困难：1.细胞核基因组庞大，背景复杂；2.导入的外源基因随机插入到核基因组中；3.外源基因表达效率低，且表达不稳定；4.有时外源基因的插入会引起其他性状的变异，从而影响其经济价值；5.安全性不好，外源基因容易扩散等。这些问题严重制约着外源基因转化技术的改进及其在实践中的应用。叶绿体转化技术可以克服以上缺点。1988年，Boynton等构建了莱茵衣藻的叶绿体稳定转化体系，首次证明了叶绿体转化的可行性（Boynton等，Science,1988）。在此之后，叶绿体转化技术被成功的应用于烟草等高等植物（Svab等，ProcNatlAcadSci，1990）。与核转化相比，叶绿体转化技术具有如下特点：1.外源基因可以定向插入；2.外源基因表达效率高、变异小；3.叶绿体基因组属于原核表达系统，多个基因形成多顺反子，可以实现同时表达；4.生物安全性高。叶绿体转化系统包括以下两个关键因素：一是合适的叶绿体转化载体；二是有效的载体导入细胞方法。合适的叶绿体转化载体包括同源片段、选择标记基因和具备叶绿体启动、终止功能的调控序列。叶绿体转化基于同源重组的原理，叶绿体表达载体中，外源基因两侧各具有一段叶绿体的同源片段，长度约1Kb，较长的同源片段有利于同源重组的发生。同时，为了防止外源基因插入引起的致死效应和重要序列的丢失，还应选择合适的插入位点。此外，叶绿体基因组的拷贝数很高，需要建立高效的选择系统，如抗生素和除草剂等筛选，使叶绿体转基因细胞实现同质化，因而选择标记基因是影响叶绿体转化效率的关键因素。外源基因需要能够在叶绿体中起作用的启动子和终止子，来保障外源基因整合后在叶绿体中的稳定高效表达。常用的有效的将载体导入叶绿体基因组的方法是基因枪法（Genegun），该方法首先在衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）中成功实现了叶绿体基因组的转化，之后被广泛应用于高等植物和藻类的叶绿体遗传改造中。其基本原理是通过动力系统将带有靶基因DNA的金属颗粒（金粒或钨粒），以一定的速度射进细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。微弹耗材往往采用钨粉或金粉，两者相比较，金粉可能比钨粉对细胞的伤害与毒性更小，且颗粒大小一致。钨粉比较便宜，但对某些细胞可能有毒害作用。因此，金粉往往被用于叶绿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种向微拟球藻叶绿体中导入外源基因的载体，其特征在于，所述载体包括SEQ IDNO:1所示的DNA片段、SEQ ID NO:2所示的DNA片段以及插入两者之间的外源基因；所述载体还具有微拟球藻叶绿体表达适用的启动子、终止子和选择标记的DNA片段。

【技术特征摘要】
1.一种向微拟球藻叶绿体中导入外源基因的载体，其特征在于，所述载体包括SEQIDNO:1所示的DNA片段、SEQIDNO:2所示的DNA片段以及插入两者之间的外源基因；所述载体还...

【专利技术属性】
技术研发人员：路延笃，徐健，辛一，魏力，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37