家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用技术

本发明专利技术公开了一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用，将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌活性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽。本发明专利技术提供了一条简便、快捷、高效、蛋白质得率高、抗菌活性稳定及活性较好的抗菌肽提取路线，使抗菌肽制备时间缩短，提高了分离纯化的效率。而且经实验证明：该抗菌肽具有提高特异性和非特异性免疫功能的作用，对细菌感染有一定的保护作用，为抗菌肽在制备药物、保健品以及动物饲料或防腐剂中的应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用，属于昆虫抗菌肽的分离纯化

技术介绍
昆虫每天都会直接接触、食入、吸入成千上万的病原微生物而不至于患感染性疾病，这种抵抗外来致病微生物的能力主要是通过天然免疫的防御机制得以实现。抗菌肽是所有物种中天然防御机制的重要组成部分，这类多肽可以是固有表达的，也可以被病原微生物及其产物诱导表达。昆虫抗菌肽是一类分子量小、水溶性好、稳定、抗菌谱广且抗菌机制独特的多肽，是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的物质。不少科学家认为，昆虫具有惊人的天然免疫力，并以抗菌肽作为其宿主防御机制的主要成分。抗菌肽除有非特异性的抗病原微生物外，还有抗肿瘤细胞的作用，而对人体的正常细胞无破坏作用。因此，抗菌肽的开发和利用是目前抗病原微生物药物开发研究中的一个热点。家蝇是重要的医学昆虫，能够机械传播人、畜多种病原菌如细菌、病毒和寄生虫卵等。目前国内外报道已从其幼虫血淋巴中分离到了多种抗细菌、真菌、原虫的生物活性抗菌蛋白/多肽，在幼虫体外分泌物中发现了广谱的抗植物病原菌、植物根结线虫及寄生虫卵的物质。但这些研究多集中于抗菌肽的诱导及活性检测阶段，而体外不同环境对其抗菌活性的影响均无报道。目前，抗菌肽的纯化方法多使用性质温和的凝胶层析，但该方法所需时间较长，每次上样量及目的蛋白的回收量较小。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用。本专利技术采用透析、固相萃取、超滤和反相高效液相色谱方法从家蝇幼虫分泌物中分离到具广谱抗菌活性的肽类物质，使抗菌肽制备时间缩短，提高了分离纯化的效率，而且该抗菌肽在体外不同的环境中其抗菌活性具有较强的稳定性，可通过破坏细菌细胞膜通透性、抑制细菌体分裂、阻碍与细胞分裂相关的某些蛋白质的合成等途径发挥抗菌作用；具有提高特异性和非特异性免疫功能的作用，对细菌感染有一定的保护作用。本专利技术是这样实现的家蝇分泌型抗菌肽的分离方法为将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌活性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽。所述的抗菌肽粗提液，即家蝇幼虫外分泌物粗提液的制备为取三龄家蝇幼虫置于干净大烧杯中，充分清洁体表后浸于适量蒸馏水中4小时，不时振摇；吸取浸液离心10000g×10min，上清液冷冻干燥浓缩，即得抗菌肽粗提液，4℃保存备用。具体的分离方法为(1)透析将浓缩的抗菌肽粗提液用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析过夜，其间换掉外液两次；取内液用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，-20℃保存备用；(2)固相萃取取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脱，流速为1ml/min；各洗脱组分冷冻干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超纯水溶解，检测该洗脱组分的抗菌活性；收集、浓缩、冻干具有活性的组分，超纯水溶解，12000rpm离心10min，收集上清液-20℃保存备用；(3)超滤将固相萃取活性组分合并后加到截留分子量为3KD的超滤管中，5000×g离心30min分离；继续将未透过超滤管的组分加到截留分子量为30KD的超滤管中，同上离心，分别收集超滤管中和管下液体，将活性物质分为三个部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各组分检测蛋白浓度和抗菌活性；(4)反相高效液相色谱纯化超滤后活性组分用0.22μm微孔滤膜过滤，100μl上C18反相色谱柱，流动相A0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色谱柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脱条件为梯度洗脱，30min内己腈浓度从5％上升到60％流速1ml/min，手工收集214nm波长洗脱峰，即获得两个抗菌肽组分。以上所用的Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱在加样前预用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C18反相色谱柱为Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm。上述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法分离得到的家蝇分泌型抗菌肽。上述家蝇分泌型抗菌肽在制备提高特异性或非特异性免疫功能、抗细菌感染的药物或保健品中的应用。上述家蝇分泌型抗菌肽在动物饲料或防腐剂中的应用。本专利技术以家蝇幼虫体外分泌物为原料，采用现代分离纯化技术，对幼虫外分泌型抗菌肽的分离、纯化及其性质进行了研究，并初步探讨了该抗菌肽的抑菌机理。同时，将抗菌肽应用于正常和感染小鼠，研究其对小鼠免疫功能、血液生化指标及重要器官病理变化的影响，为昆虫抗菌肽的开发及应用提供了理论基础。一、本专利技术抗菌肽的分离纯化专利技术人通过研究摸索到一条纯化时间短、蛋白质得率高、抗菌活性稳定及活性较好的抗菌肽提取路线首先用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析除掉粗提液中的盐及小分子杂质，透析内液进一步用0％-80％的甲醇进行固相萃取梯度洗脱，洗脱组分冷冻干燥浓缩，再经30KD超滤管超滤处理，除掉大分子的无活性成分，余下组分进一步用C18反相高效液相色谱纯化，最终在15.5min和18.5min处得到两个活性蛋白峰，紫外吸收光谱分析证明为蛋白肽类物质。整个纯化过程纯化倍数为27.93倍，活性回收率9.62％。抗菌肽常常存在于胞浆颗粒中，其分子量较低。一般而言，提取多肽样品的方法主要有水浸提法、有机溶剂抽提法和有机酸抽提法等。本研究采用的抗菌肽提取方法是基于专利技术人的长期摸索，将几种纯化方法进行详细比较以后得到的较为成熟和简便的方法。首先，考虑到家蝇幼虫分泌物粗提液中除了其分泌的抗菌肽以外，还有许多肠道的一些内容物、盐类和其他小分子物质，因此，我们利用截留分子量为3500D的透析袋将粗提液进行透析，以此除掉小分子的杂质和盐类等物质。固相萃取是目前对生物分子分离的一种常用方法，本专利技术使用的是Sep-Pak C18Cartridge柱，该柱能减少样品制备的时间，操作简便，快捷。可完成纯化、样品富积或浓缩、分级分离及溶剂交换等工作。在样品的分级分离中，根据分析物极性的不同，采用梯度增加溶剂强度的办法，选择性地洗脱和分离分析物。透析以后的幼虫分泌物经固相萃取后，0％、10％、20％、30％组分固体培养法和液体培养法均没有显示抗菌活性，而40％-50％组分活性弱且不稳定，仅60％～80％组分具有较强抗菌活性，而且活性非常稳定。专利技术人前期在摸索固相萃取条件的同时也采用凝胶层析的老方法来分离分泌物抗菌肽，但综合比较，效果始终不如固相萃取好，主要是后者所需时间长，层析后样品还需要脱盐，而且活性的稳定性也没有萃取高，因此，本专利技术最终选择了固相萃取来分离抗菌肽。超滤是一种膜分离的单元操作，它是利用膜的选择性，溶液各组分透过膜的迁移率不同而分离，在分离中被传递的是溶剂，属于速率控制的传质过程，具有操作方便，无相变，无化学变化，处理效率高和节能等优点。专利技术人将萃取活性组分合并后，分步使用截留分子量为3KD和30KD的超滤管，发现活性组分分子量介于3-30KD间，符合前人研究的结论。高效液相色谱在生物分子的分离纯化中具有独特的优点，为生物分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法，其特征在于：将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌活性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建伟，国果，宋智魁，付萍，秦容贵，张勇，
申请(专利权)人：贵阳医学院，
类型：发明
国别省市：52[中国|贵州]